Πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα

Τι είναι τα πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα;

Τα πρωτογενή κύτταρα αποτελούν την πιο καθαρή αναπαράσταση των αντίστοιχων ιστών τους. Απομονώνονται από τον ιστό και υποβάλλονται σε επεξεργασία, ώστε να μπορούν να αναπτυχθούν σε περιβάλλον καλλιέργειας υπό ιδανικές συνθήκες. Μιμούνται πιο πιστά την κατάσταση in vivo και παρουσιάζουν φυσιολογική λειτουργία, καθώς προέρχονται από ιστό και δεν έχουν υποστεί τροποποίηση. Για τον λόγο αυτό, μπορούν να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα μοντέλα για την έρευνα στην κυτταρική φαρμακολογία, την τοξικολογία και τη φυσιολογία (συμπεριλαμβανομένων μελετών σχετικά με το μεταβολισμό, τη γήρανση και τη μεταγωγή σήματος). Πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι τα πρωτογενή κύτταρα είναι πιο δύσκολο να καλλιεργηθούν και να διατηρηθούν σε σύγκριση με μια συνεχή κυτταρική σειρά, καθώς έχουν μικρότερη διάρκεια ζωής και σταματούν να διαιρούνται (ή γηράσκουν) μετά από έναν συγκεκριμένο αριθμό κυτταρικών διαιρέσεων. Οι μελέτες των οδών κυτταρικής σηματοδότησης περιπλέκονται από την εγγενή μεταβλητότητα των πρωτογενών κυττάρων που λαμβάνονται από δότες και μέσω πρακτικών υποκαλλιέργειας. Πριν από την έναρξη των μελετών σηματοδότησης, οι ερευνητές συχνά διεξάγουν διαλογή για να προσδιορίσουν εάν τα κύτταρα ανταποκρίνονται ή όχι σε κοινά χρησιμοποιούμενα ερεθίσματα. Για να αποφευχθεί η σπατάλη χρόνου και χρημάτων, τα πρωτογενή κύτταρα μπορούν να υποβληθούν σε διέγερση ώστε να ενεργοποιηθούν οι κύριες οδοί σηματοδότησης πριν από τη διαλογή.

Γιατί να χρησιμοποιούνται ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα;

Οι αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιούνται συνήθως ως κυτταρική δοκιμασία. Ωστόσο, οι επιστήμονες έχουν αναγνωρίσει ότι οι βιολογικές αλλαγές που οφείλονται στις κυτταρικές σειρές ενδέχεται να είναι επιζήμιες για τη μελέτη της φυσιολογικής τους σημασίας. Η χρήση πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων βελτιώνει τη φυσιολογική αξία των δεδομένων που λαμβάνονται μέσω κυτταρικών καλλιεργειών, και θεωρούνται όλο και περισσότερο σημαντικά για τη μελέτη βιολογικών διεργασιών, της εξέλιξης ασθενειών και της ανάπτυξης φαρμάκων.

Τα ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα χρησιμοποιούνται ευρέως σε in vitro μελέτες της διακυτταρικής και ενδοκυτταρικής επικοινωνίας, της αναπτυξιακής βιολογίας, καθώς και των μηχανισμών που διέπουν τον καρκίνο, τη νόσο του Πάρκινσον και τον διαβήτη, μεταξύ πολλών άλλων προκλινικών και ερευνητικών τομέων της βιολογικής έρευνας. Οι ερευνητές χρησιμοποιούν εδώ και καιρό αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές για τη μελέτη της λειτουργίας των ιστών· ωστόσο, οι κυτταρικές σειρές με εμφανείς μεταλλάξεις και χρωμοσωμικές ανωμαλίες ενδέχεται να μην αποτελούν καλούς υποκατάστατους των φυσιολογικών κυττάρων και της εξέλιξης της νόσου στα αρχικά της στάδια. Ένα πιο ακριβές μοντέλο ενός συγκεκριμένου τύπου κυττάρου ιστού μπορεί πλέον να επιτευχθεί με τη χρήση πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων που έχουν απομονωθεί από τον εν λόγω ιστό και διατηρούνται σε μέσα καλλιέργειας πρωτογενών κυττάρων και συμπληρώματα.

Τι είναι η πρωτογενής κυτταρική καλλιέργεια;

Αντί της χρήσης αθανατοποιημένων κυτταρικών σειρών, η πρωτογενής κυτταρική καλλιέργεια περιλαμβάνει την ανάπτυξη κυττάρων απευθείας από έναν πολυκυτταρικό οργανισμό εκτός του σώματος. Σε ορισμένες χώρες, όπως το Ηνωμένο Βασίλειο, αναγνωρίζεται νομικά το γεγονός ότι οι πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες είναι πιο αντιπροσωπευτικές των ιστών in vivo σε σχέση με τις κυτταρικές σειρές. Παρ’ όλα αυτά, τα πρωτογενή κύτταρα χρειάζονται το κατάλληλο υπόστρωμα και θρεπτικά συστατικά για να αναπτυχθούν, και μετά από έναν ορισμένο αριθμό διαιρέσεων, αναπτύσσουν έναν φαινότυπο γήρανσης που τα αναγκάζει να σταματήσουν μόνιμα να διαιρούνται. Αυτοί οι δύο παράγοντες αποτελούν κίνητρο για τη δημιουργία κυτταρικών σειρών. Τόσο τα φυσικά αθανατοποιημένα πρωτογενή κύτταρα (π.χ. κύτταρα HeLa) όσο και τα τεχνητά αθανατοποιημένα πρωτογενή κύτταρα (π.χ. κύτταρα HEK) μπορούν να καλλιεργηθούν επ’ αόριστον σε κυτταρική καλλιέργεια.

Πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα ανά τύπο ιστού

Τα επιθηλιακά κύτταρα, οι ινοβλάστες, τα κερατινοκύτταρα, τα μελανοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μυϊκά κύτταρα, τα ανοσοκύτταρα και τα βλαστοκύτταρα, όπως τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, συγκαταλέγονται στα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα στην επιστημονική έρευνα. Κατ’ αρχάς, οι καλλιέργειες είναι ετερογενείς (αντιπροσωπεύουν ένα μείγμα κυτταρικών τύπων που υπάρχουν στον ιστό) και μπορούν να διατηρηθούν ζωντανές in vitro μόνο για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Ο μετασχηματισμός είναι μια διαδικασία in vitro που επιτρέπει τον χειρισμό των πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων για απεριόριστες υποκαλλιέργειες. Ο μετασχηματισμός μπορεί να συμβεί φυσικά ή να προκληθεί από χημικές ουσίες ή ιούς. Αφού υποβληθεί σε γενετικό μετασχηματισμό, μια πρωτογενής καλλιέργεια μπορεί να διαιρείται επ’ αόριστον, δημιουργώντας μια αθανατοποιημένη δευτερογενή κυτταρική σειρά, εφόσον της παρασχεθούν επαρκείς θρεπτικές ουσίες και χώρος.

Ενδοθηλιακά κύτταρα

Η θεραπεία του καρκίνου, η επούλωση τραυμάτων, η έρευνα σχετικά με τη κυτταρική σηματοδότηση, ο έλεγχος υψηλής απόδοσης και υψηλού περιεχομένου, καθώς και ο τοξικολογικός έλεγχος είναι μόνο μερικοί από τους τομείς που μπορούν να επωφεληθούν από τη χρήση πρωτογενών ενδοθηλιακών κυττάρων ως ερευνητικού εργαλείου.

Κερατινοκύτταρα

Τα κερατινοκύτταρα, που προέρχονται από την επιδερμίδα είτε του δέρματος ενήλικου ανθρώπου είτε της περιτομής νεογνού, διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη μελέτη δερματικών παθήσεων όπως η ψωρίαση και ο καρκίνος.

Επιθηλιακά κύτταρα

Από τις μελέτες για τον καρκίνο έως τις τοξικολογικές έρευνες, τα πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα έχουν αποδειχθεί ανεκτίμητοι πόροι για τη μοντελοποίηση των φυσικών αμυνών του οργανισμού.

Ινοβλάστες

Η επαγωγή πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (iPS) και η μελέτη της επούλωσης τραυμάτων είναι μόνο μερικές από τις πολλές χρήσεις των πρωτογενών ινοβλαστών.

Ανοσοκύτταρα

Τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος, γνωστά και ως PBMC, είναι μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος με στρογγυλό πυρήνα. Περιλαμβάνουν κυρίως λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα, τα οποία αναλαμβάνουν σημαντικές λειτουργίες κατά τη διάρκεια μιας ανοσοαπόκρισης. Τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος χρησιμοποιούνται συχνά για τη διάγνωση λοιμώξεων ή για την ανίχνευση πιθανής προστασίας από εμβολιασμό. Η κατανόηση της κυτταρικής ανοσοαπόκρισης που μεσολαβείται από τα Τ-κύτταρα είναι συχνά κρίσιμη.

Μελανοκύτταρα

Τα μελανοκύτταρα, τα εξειδικευμένα κύτταρα του δέρματος που παράγουν τη χρωστική μελανίνη, είναι χρήσιμα ως μοντέλα για την έρευνα σε θέματα όπως η επούλωση τραυμάτων, η τοξικότητα, το μελάνωμα, η δερματική απόκριση στην υπεριώδη (UV) ακτινοβολία, οι δερματικές παθήσεις και τα καλλυντικά.

Βλαστικά κύτταρα

Τα βλαστοκύτταρα έχουν τη δυνατότητα να διαφοροποιηθούν σε μια ευρεία ποικιλία κυτταρικών τύπων. Λόγω της ικανότητάς τους να διαφοροποιούνται, προσφέρουν νέες ευκαιρίες για τη μοντελοποίηση ανθρώπινου ιστού και παθήσεων.

Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα

Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, γνωστά και ως MSC, μπορούν να ληφθούν από διάφορες ανθρώπινες πηγές, όπως ο μυελός των οστών, το λίπος (λιπώδης ιστός), ο ιστός του ομφάλιου λώρου (ζελέ του Wharton) και το αμνιακό υγρό (το υγρό που περιβάλλει το έμβρυο), και μπορούν να πολλαπλασιαστούν in vitro. Αυτά τα ενήλικα στρωματικά βλαστοκύτταρα έχουν την ικανότητα να εξελιχθούν σε μια ευρεία ποικιλία κυτταρικών τύπων. Μερικοί από αυτούς τους κυτταρικούς τύπους περιλαμβάνουν οστικά κύτταρα, χόνδρινα κύτταρα, μυϊκά κύτταρα, νευρικά κύτταρα, δερματικά κύτταρα και κύτταρα του κερατοειδούς.

Κύτταρα λείου μυός

Στα κοίλα όργανα, τα πρωτογενή κύτταρα λείου μυός (SMCs) επενδύουν το εσωτερικό τους και μεσολαβούν στη συσταλτικότητα. Εκτός από τον καρκίνο και άλλες ασθένειες, τα SMCs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μοντελοποίηση της ίνωσης που προκαλεί η υπέρταση.

Πρωτογενή κύτταρα και κυτταρικές σειρές

Είτε μέσω αυθόρμητης μετάλλαξης, όπως στις μετασχηματισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές, είτε μέσω σκόπιμης αλλοίωσης, όπως στην τεχνητή παραγωγή καρκινικών γονιδίων, οι συνεχείς κυτταρικές σειρές έχουν αποκτήσει τη δυνατότητα να αναπαράγονται ατέρμονα (αθανατοποιημένες). Κατά κανόνα, οι συνεχείς κυτταρικές σειρές είναι πιο αξιόπιστες και πιο εύχρηστες από τα πρωτογενή κύτταρα. Μπορούν να πολλαπλασιάζονται επ’ αόριστον και παρέχουν γρήγορη πρόσβαση σε βασικά δεδομένα. Η χρήση συνεχών κυτταρικών σειρών έχει ορισμένους περιορισμούς, μεταξύ των οποίων το γεγονός ότι είναι γενετικά τροποποιημένες/μετασχηματισμένες, κάτι που ενδέχεται να μεταβάλλει τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά τους και να μην αντιστοιχεί στις συνθήκες in vivo, καθώς και το ότι αυτά μπορεί να μεταβληθούν περαιτέρω με την πάροδο του χρόνου λόγω των επαναλαμβανόμενων διαβιβάσεων.

Εξελίξεις στην καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων

Τα πρωτογενή κύτταρα έχουν τη φήμη ότι είναι δύσκολο να εργαστεί κανείς μαζί τους. Η διαδικασία, ωστόσο, γίνεται ευκολότερη από ποτέ χάρη στις εξελίξεις στην καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων, στη διαθεσιμότητα εμπορικών πρωτογενών κυττάρων με πλήρως βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα και σε νέες τεχνικές ανάλυσης που απαιτούν λιγότερη εργασία.

Η μετάβαση από τη δισδιάστατη στην τρισδιάστατη κυτταρική καλλιέργεια θεωρείται σημαντικό ορόσημο στον τομέα. Η ιστοειδική αρχιτεκτονική, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων και η μηχανική/βιοχημική σηματοδότηση ενδέχεται να εξασθενίζουν σε μια δισδιάστατη καλλιέργεια. Ως εκ τούτου, υπάρχει ένα ανώτατο όριο στη βιολογική αξία αυτών των καλλιεργειών.

Από την άλλη πλευρά, η τρισδιάστατη κυτταρική καλλιέργεια επιτρέπει στα κύτταρα να πολλαπλασιάζονται και να αλληλεπιδρούν με ένα τρισδιάστατο εξωκυτταρικό πλαίσιο. Αυτό επιτρέπει στα κύτταρα να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με την εξωκυτταρική μήτρα, καθιστώντας τις τρισδιάστατες καλλιέργειες πιο φυσιολογικά σχετικές. Η ακρίβεια αυτής της μεθόδου στην πρόβλεψη των in vivo αντιδράσεων την έχει καταστήσει επαναστατική σε τομείς όπως η ανακάλυψη και η ανάπτυξη φαρμάκων. Εξαιτίας αυτού, τεχνολογίες αιχμής, όπως τα οργανοειδή που προέρχονται από ασθενείς και τα «όργανα σε τσιπ», παρέχουν μοντέλα με υψηλό βαθμό συνάφειας για τον έλεγχο και την ανάπτυξη φαρμάκων.

Η παραγωγή πρωτογενών κυττάρων αποτελεί σημείο συμφόρησης στην πρωτογενή καλλιέργεια. Για να ξεπεραστεί αυτό, απαιτείται συνήθως μεγαλύτερος όγκος ιστού, κάτι που μπορεί να είναι δύσκολο να επιτευχθεί. Ωστόσο, η βελτιωμένη αναλυτική ευαισθησία προσφέρει μια λύση. Για παράδειγμα, η ανάγκη καλλιέργειας μεγάλων ποσοτήτων πρωτογενών κυττάρων μειώνεται με τη χρήση τεχνολογίας μονοκυττάρων, η οποία περιλαμβάνει αλληλούχιση, western blotting και κυτταρομετρία μάζας.

Ελπιδοφόρες προοπτικές για την καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων

Οι γενικές δυσκολίες της καλλιέργειας πρωτογενών κυττάρων μετριάζονται χάρη στις τεχνολογικές εξελίξεις. Με τη σειρά της, αυτή η μέθοδος αντικαθιστά ραγδαία άλλες μεθόδους ως το «χρυσό πρότυπο» στη μελέτη και την πρακτική της κυτταρικής και μοριακής βιολογίας. Η παραγωγή εμβολίων, η αντικατάσταση οργάνων, οι θεραπείες με βλαστικά κύτταρα, η έρευνα για τον καρκίνο και πολλά άλλα θα επωφεληθούν σημαντικά από τις συνεχείς εξελίξεις στην καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων.

Συμβουλές και κόλπα για την καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων

Οι ανάγκες της κυτταρικής πολλαπλασιασμού

Οι δύο πιο συνηθισμένες μέθοδοι καλλιέργειας πρωτογενών κυττάρων είναι σε εναιώρημα ή επί επιφάνειας (2D). Ορισμένα κύτταρα είναι ικανά να επιπλέουν ελεύθερα στην κυκλοφορία του αίματος χωρίς ποτέ να προσκολλώνται σε κάποια επιφάνεια (για παράδειγμα, εκείνα που προέρχονται από το περιφερικό αίμα). Έχουν δημιουργηθεί διάφορες κυτταρικές σειρές ώστε να αναπτύσσονται σε καλλιέργειες εν αιώρησης, όπου μπορούν να φτάσουν σε πυκνότητες που δεν είναι εφικτές υπό συνθήκες ανάπτυξης 2D. Τα πρωτογενή κύτταρα που χρειάζονται προσκόλληση για να αναπτυχθούν in vitro ονομάζονται προσκολλητικά κύτταρα και περιλαμβάνουν εκείνα που βρίσκονται σε συμπαγείς ιστούς. Για τη βελτίωση των ιδιοτήτων προσκόλλησης και την παροχή άλλων σημάτων που απαιτούνται για την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση, τα κύτταρα αυτά καλλιεργούνται συνήθως σε επίπεδο πλαστικό δοχείο χωρίς επίστρωση, αλλά περιστασιακά και σε μικροφορέα. Η τελευταία αυτή επιλογή μπορεί να είναι επικαλυμμένη με πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας (όπως κολλαγόνο και λαμινίνη). Τα μέσα που χρησιμοποιούνται στην κυτταρική καλλιέργεια αποτελούνται από ένα βασικό μέσο που έχει εμπλουτιστεί με τους κατάλληλους αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες. Ο κυτταρικός επωαστήρας είναι ένας ειδικός τύπος εργαστηριακού επωαστήρα που χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια και τη διατήρηση των κυττάρων σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και μίγμα αερίων (συνήθως 37 °C, 5% CO₂ για κύτταρα θηλαστικών). Ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων που καλλιεργούνται, οι βέλτιστες συνθήκες μπορεί να διαφέρουν σημαντικά. Ανάλογα με τους τύπους των κυττάρων που αναπτύσσονται, το βέλτιστο μέσο ανάπτυξης θα έχει έναν μοναδικό συνδυασμό παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, του pH, της συγκέντρωσης γλυκόζης, των αυξητικών παραγόντων και της παρουσίας άλλων θρεπτικών συστατικών.

Τα αντιβιοτικά στο μέσο ανάπτυξης είναι ζωτικής σημασίας κατά τη δημιουργία της πρωτογενούς καλλιέργειας, προκειμένου να προληφθεί η μόλυνση από τον ιστό του ξενιστή. Ορισμένα σχήματα αντιβιοτικής αγωγής περιλαμβάνουν συνδυασμό γενταμικίνης, πενικιλλίνης, στρεπτομυκίνης και αμφοτερικίνης Β. Ωστόσο, η χρήση αντιβιοτικών για παρατεταμένο χρονικό διάστημα δεν συνιστάται, καθώς ορισμένα αντιδραστήρια (όπως η αμφοτερικίνη Β) ενδέχεται να είναι τοξικά για τα κύτταρα μακροπρόθεσμα.

Τα περισσότερα πρωτογενή κύτταρα υφίστανται γήρανση και σταματούν να διαιρούνται μετά από έναν ορισμένο αριθμό διπλασιασμών του πληθυσμού, γεγονός που καθιστά ζωτικής σημασίας τη διατήρησή τους ζωντανών μετά την απομόνωση. Η μακροπρόθεσμη βιωσιμότητα των κυττάρων απαιτεί εξειδικευμένες τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας και ιδανικές συνθήκες καλλιέργειας (συμπεριλαμβανομένου του κατάλληλου μέσου, της κατάλληλης θερμοκρασίας, του κατάλληλου μίγματος αερίων, του κατάλληλου pH, της κατάλληλης συγκέντρωσης αυξητικών παραγόντων, της παρουσίας θρεπτικών ουσιών και της παρουσίας γλυκόζης). Δεδομένου ότι πολλοί από τους αυξητικούς παράγοντες που χρησιμοποιούνται για τη συμπλήρωση των θρεπτικών μέσων προέρχονται από ζωικό αίμα (τα συστατικά που προέρχονται από αίμα ενέχουν κίνδυνο μόλυνσης), συνιστάται η χρήση τους να περιοριστεί στο ελάχιστο ή να αποφεύγεται εντελώς. Είναι επίσης σημαντικό να χρησιμοποιείται ασηπτική τεχνική.

Υποκαλλιέργεια και συντήρηση

Όταν τα απομονωμένα κύτταρα προσκολληθούν στην επιφάνεια του πιάτου καλλιέργειας, αυτό σηματοδοτεί την έναρξη της φάσης συντήρησης. Η προσκόλληση συμβαίνει συνήθως 24 ώρες μετά την έναρξη της καλλιέργειας. Τα κύτταρα πρέπει να υποκαλλιεργούνται όταν έχουν φτάσει σε ένα συγκεκριμένο ποσοστό σύγκλισης και πολλαπλασιάζονται ενεργά. Δεδομένου ότι τα κύτταρα μετά τη σύγκλιση ενδέχεται να υποστούν διαφοροποίηση και να παρουσιάσουν βραδύτερο πολλαπλασιασμό μετά τη μεταφύτευση, είναι προτιμότερο να υποκαλλιεργούνται οι πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες πριν φτάσουν στο 100% σύγκλισης.

Η υποκαλλιέργεια σε φρέσκο μέσο διατηρεί την εκθετική ανάπτυξη των κυττάρων που εξαρτώνται από την πρόσφυση. Η υποκαλλιέργεια μονοστρωμάτων διακόπτει τις διακυτταρικές και ενδοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις στην κυτταρική επιφάνεια. Χρησιμοποιούνται χαμηλές συγκεντρώσεις πρωτεολυτικών ενζύμων, όπως η τρυψίνη/EDTA, για την απομόνωση προσκολλημένων πρωτογενών κυττάρων από μονοστρωματικές καλλιέργειες ή ιστούς. Αφού αποσυνδεθούν και αραιωθούν σε διάλυμα μονοκυτταρικού συμπυκνώματος, τα κύτταρα καταμετρούνται και μεταφέρονται σε φρέσκους περιέκτες καλλιέργειας για να επαναπροσκολληθούν και να πολλαπλασιαστούν.

Κρυοσυντήρηση και ανάκτηση

Η κρυοσυντήρηση διατηρεί τα ζωντανά κύτταρα μέσω της κατάψυξής τους σε χαμηλές θερμοκρασίες. Η κρυοσυντήρηση και η απόψυξη των ανθρώπινων πρωτογενών κυττάρων αποτρέπει τον κυτταρικό θάνατο και τη βλάβη κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης και της χρήσης. Τα ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα προστατεύονται κατά την κατάψυξη με τη χρήση DMSO ή γλυκερόλης (στη σωστή θερμοκρασία και με ελεγχόμενο ρυθμό κατάψυξης). Η διαδικασία κατάψυξης πρέπει να είναι σταδιακή, με ρυθμό -1 °C ανά λεπτό, για την αποφυγή σχηματισμού κρυστάλλων πάγου. Η μακροχρόνια αποθήκευση απαιτεί υγρό άζωτο (-196 °C) ή θερμοκρασίες κάτω των -130 °C.

Η εμβάπτιση των κατεψυγμένων κυττάρων σε υδατόλουτρο 37 °C για περίπου 1 έως 2 λεπτά αρκεί για την απόψυξη των κρυοσυντηρημένων κυττάρων. Τα πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα δεν πρέπει να φυγοκεντρίζονται μετά την απόψυξή τους από τον καταψύκτη (καθώς είναι εξαιρετικά ευαίσθητα σε βλάβες κατά την ανάκτηση από την κρυοσυντήρηση). Είναι κατάλληλο για την επίστρωση κυττάρων αμέσως μετά την απόψυξη και προάγει την προσκόλληση στις καλλιέργειες κατά τις πρώτες 24 ώρες μετά την επίστρωση. 1 Αφού προσκολληθούν τα κρυοσυντηρημένα πρωτογενή κύτταρα, τα χρησιμοποιημένα μέσα καλλιέργειας πρέπει να απομακρυνθούν (καθώς το DMSO είναι επιβλαβές για τα πρωτογενή κύτταρα και μπορεί να προκαλέσει πτώση της βιωσιμότητας μετά την απόψυξη).