Udgivet: 2023 | Senest revideret: maj 2026

Teknikker til dissociation af cellekulturer

Dissociation af cellekulturer er et afgørende trin i vedligeholdelsen af cellekulturer. Det indebærer at løsne cellerne fra deres vækstoverflade for at muliggøre subkultivering eller høst. Dette afsnit beskriver to hovedmetoder: brug af enzymfrie dissociationsbuffere og brug af enzymatiske reagenser.

Brug af enzymfrie celledissociationsbuffere

Denne metode er skånsom og bevarer cellernes integritet uden brug af enzymer:

1. Forberedelse
   • Sørg for, at alle reagenser er opvarmet til 37 °C før brug for at undgå chok for cellerne.
2. Fjernelse af vækstmedium:
   • Kassér det gamle vækstmedium fra dyrkningsbeholderen.
3. Skylning
   • Skyl cellemonolagene med 5 ml calcium- og magnesiumfrit PBS pr. T75-kolbe eller 100 mm-skål.
   • Ryst beholderen forsigtigt i 30 til 60 sekunder ved stuetemperatur.
   • Sug skyllevæsken op og bortskaf den.
   • Gentag dette skylletrin endnu en gang.
4. Dissociation
   • Tilsæt ca. 5 ml enzymfri Cell Dissociation Buffer til beholderen.
   • Ryst forsigtigt ved stuetemperatur i 1 til 2 minutter, og kontroller for dissociation under et mikroskop.
   • Bank kolben eller skålen mod hånden for at løsne cellerne, hvis det er nødvendigt.
   • Hvis cellerne klæber fast, lad dem stå ved stuetemperatur i yderligere 2 til 5 minutter, og bank igen, hvis det er nødvendigt, ved at bruge mere dissociationsbuffer.
   • Når cellerne er løsnet, tilsættes mindst 5 ml komplet vækstmedium for at neutralisere dissociationsbufferen og resuspendere cellerne.
5. Kontrol af levedygtighed
   • Overvåg cellernes levedygtighed under subkultivering, og sørg for, at den forbliver over 90 %.

Brug af andre reagenser til dissociation

Denne metode muliggør anvendelse af forskellige dissociationsreagenser:

1. Fjernelse af brugt medium
   • Kassér det gamle medium fra dyrkningsbeholderen.
2. Vask af celler
   • Vask cellerne med en afbalanceret saltopløsning uden calcium og magnesium, eller brug EDTA.
   • Tilsæt vaskeopløsningen forsigtigt på den side, der vender væk fra cellerne, og vug beholderen i 1 til 2 minutter, inden vaskeopløsningen bortskaffes.
3. Dissociation
   • Påfør 2 til 3 ml af den valgte dissociationsopløsning pr. 25 cm² vækstoverflade, og sørg for, at cellearket er dækket.
   • Inkuber beholderen ved 37 °C og vug den forsigtigt. Dissociation sker typisk inden for 5 til 15 minutter, afhængigt af cellelinjen.
   • For genstridige celler kan det fremskynde processen at banke let på beholderen.
   • Overvåg cellerne nøje for at undgå overeksponering og potentiel beskadigelse.
4. Høstning af celler
   • Når cellerne er fuldt løsnet, skal de samles i bunden af beholderen ved at stille den oprejst.
   • Tilsæt komplet medie, og spred og opsaml derefter cellerne ved at pipettere over cellelaget.
   • Tæl cellerne og fortsæt med subkultivering.

I begge metoder er det vigtigt at bestemme de optimale betingelser for hver cellelinje gennem empirisk observation. Processen skal bevare cellernes levedygtighed, som rutinemæssigt skal kontrolleres for at sikre, at den overstiger 90 % under subkultivering. Disse procedurer danner grundlag for, at forskere kan tilpasse sig ud fra de specifikke krav og egenskaber ved deres cellelinjer.

Oversigt over teknikker til subkultivering af adhærente celler

Effektiv subkultivering af adhærente celler kræver, at de løsnes fra dyrkningsbeholderen. Der anvendes forskellige metoder, som hver især er velegnede til forskellige celletyper og betingelser. Når man vælger en dissociationsmetode, er det afgørende at tage hensyn til cellelinjens specifikke behov og eksperimentets mål. Regelmæssig overvågning af cellernes levedygtighed, med et mål på over 90 % på tidspunktet for subkultivering, er afgørende for kulturens fortsatte sundhed og produktivitet. Her er et overblik over disse procedurer: