Udgivet: 2023 | Senest revideret: maj 2026
Omfattende vejledning til nedfrysning af celler: Sikring af levedygtighed og sterilitet
Frysning af celler er en kritisk proces i cellekulturhåndtering, der sikrer langvarig opbevaring og bevarelse af værdifulde cellelinjer. Uanset om man arbejder med humane eller dyreceller, er det afgørende at følge præcise protokoller og opretholde strenge aseptiske teknikker for at opnå en vellykket kryopræservering.
Denne vejledning indeholder detaljerede instruktioner om de nødvendige materialer, reagenser og trin-for-trin-procedurer til effektiv nedfrysning af celler, samtidig med at deres levedygtighed og sterilitet bevares. Ved at følge disse retningslinjer kan forskere trygt opbevare og senere genoplive cellekulturer med minimalt tab af cellernes levedygtighed, hvilket bevarer integriteten og pålideligheden af deres eksperimentelle resultater.
For at komme i gang er det vigtigt at etablere et sterilt arbejdsmiljø. Korrekt aseptisk teknik spiller en afgørende rolle i forebyggelsen af kontaminering og sikringen af kulturernes sterilitet.
Aseptisk teknik
Følg aseptiske teknikker gennem hele processen for at sikre kulturernes sterilitet.
Omfattende cellefrysningsproces
Dette flowdiagram giver en detaljeret visuel vejledning til de væsentlige trin i korrekt nedfrysning af celler. Følg disse procedurer for at sikre høj cellelevedygtighed og integritet under kryopræserveringsprocessen.
Forberedelse af frysemedium
Forbered kryobeskyttende frysemedium i henhold til celletypen:
- FBS-holdige kulturmedier: 90 % FBS + 10 % DMSO eller 70 % vækstmedium, 20 % FBS og 10 % DMSO
- Celler, der kræver glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerol
Overvej at anskaffe vores færdigformulerede frysemedium:
- Frysemedium CM-1: Til protokoller, der kræver et medium indeholdende føtal bovint serum (FBS)
- Frysemedium CM-ACF – serumfrit: Til et FBS-frit alternativ
Mærkning og dokumentation
Mærk kryorør med følgende oplysninger:
- Dato
- Forskerens navn
- Celle nummer
- Passagenummer
- Celletype
- Eventuelle yderligere oplysninger (f.eks. genetiske modifikationer)
Celleforberedelse
For adhærente celler:
- Overvåg cellerne, indtil de når 85–95 % konfluens
- Sug det gamle dyrkningsmedium ud
- Skyl cellemonolaget med calcium- og magnesiumfrit PBS
- Løsn cellerne med Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA og neutraliser med dyrkningsmedier, hvis det er nødvendigt
- Overfør cellesuspensionen til et 50 ml Falcon-rør
For suspensionsceller:
- Kontroller celletæthed og -tilstand under et mikroskop
- Overfør cellesuspensionen direkte til et 50 ml Falcon-rør
Celleoptælling og centrifugering
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatisk celletæller
- Centrifuger ved 300 g i 3-5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne
- Sug forsigtigt supernatanten op, uden at forstyrre cellebundfaldet
- Varm det forberedte frysemedie op til 37 °C før brug
Kryopræservering
- Resuspender cellebundfaldet i frysemediet til en tæthed på 2,0 millioner celler/ml for adhærente celler og 5 millioner celler/ml for suspensionsceller eller den ønskede koncentration
- Fordel 1,0 ml (eller mere efter behov) af cellesuspensionen i mærkede kryorør
- Brug en langsom frysemetode, før cellerne overføres til langtidsopbevaring
- ? Metode
- ? Trin
-
❄️
Manuel frysning -
1️⃣ Anbring cellerne i frysemediet i en fryser ved 4 °C i 40 minutter.
2️⃣ Overfør til en fryser ved -80 °C i 24 timer.
3️⃣ Opbevar cellerne i flydende nitrogen til langtidsopbevaring. -
?
Brug af Mr. Frosty -
1️⃣ Forbered cellerne i kryorør med frysemedium.
2️⃣ Anbring kryorørene i Mr. Frosty-beholderen.
3️⃣ Opbevar ved -80 °C i 24 timer, før de overføres til flydende nitrogen. -
?
Fryser med kontrolleret hastighed -
1️⃣ Indstil enheden til gradvist at sænke temperaturen.
2️⃣ Anbring de forberedte celler i fryseren.
3️⃣ Efter frysecyklussen overføres cellerne til flydende nitrogen.
- Opbevar kryorørene ved temperaturer under -130 °C eller i flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
Materialer og reagenser
- 1–2 ml kryorør
- CoolCell®-fryseenhed eller fryser med kontrolleret hastighed
- Kryobeskyttende frysemedium (f.eks. DIY-kryobeskyttelsesmedier, CM-1, CM-ACF eller specialmedier)
- Føtal bovint serum (FBS) eller konditioneret medium
- DMSO eller glycerol
- Calcium- og magnesiumfri PBS
- Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA (til adhærente celler)
- 15 ml eller 50 ml Falcon-rør
- Hæmocytometer eller automatisk celletæller
- Centrifuge