Omfattende guide til nedfrysning af celler: Sikring af levedygtighed og sterilitet

Nedfrysning af celler er en kritisk proces inden for håndtering af cellekulturer, der sikrer langtidsopbevaring og konservering af værdifulde cellelinjer. Uanset om man arbejder med menneske- eller dyreceller, er det afgørende at følge præcise protokoller og opretholde strenge aseptiske teknikker for at opnå en vellykket kryopræservering.

Denne vejledning giver detaljerede instruktioner om de nødvendige materialer, reagenser og trinvise procedurer til effektiv nedfrysning af celler, samtidig med at deres levedygtighed og sterilitet bevares. Ved at følge disse retningslinjer kan forskere trygt opbevare og senere genoplive cellekulturer med minimalt tab af cellernes levedygtighed, hvilket opretholder integriteten og pålideligheden af deres eksperimentelle resultater.

Til at begynde med er det vigtigt at etablere et sterilt arbejdsmiljø. Korrekte aseptiske teknikker spiller en afgørende rolle for at forhindre kontaminering og sikre kulturernes sterilitet.

Aseptisk teknik

Følg aseptiske teknikker under hele processen for at sikre kulturernes sterilitet.

Omfattende proces for nedfrysning af celler

Dette flowchart giver en detaljeret visuel vejledning i de vigtige trin, der er involveret i korrekt nedfrysning af celler. Følg disse procedurer for at sikre høj cellelevedygtighed og -integritet under kryopræserveringsprocessen.

Forberedelse af frysemedium

Forbered det kryobeskyttende frysemedium i henhold til celletypen:

FBS-holdige mediekulturer: 90 % FBS + 10 % DMSO eller 70 % vækstmedium, 20 % FBS og 10 % DMSO
Celler, der kræver glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerol

Overvej at anskaffe vores præformulerede frysemedium:

FrysemediumCM-1: Til protokoller, der kræver et medium, der indeholder føtalt bovint serum (FBS)
Frysemedium CM-ACF - serumfrit: Til et FBS-frit alternativ

Mærkning og dokumentation

Mærk kryovials med følgende oplysninger:

Dato
Forskerens navn
Cellenummer
Nummer på passage
Celletype
Eventuelle yderligere oplysninger (f.eks. genetiske modifikationer)

Forberedelse af celler

For adhærente celler:

Overvåg cellerne, indtil de når 85-95 % konfluens
Aspirer det gamle dyrkningsmedium
Skyl cellelaget med calcium- og magnesiumfri PBS
Løsgør cellerne med Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA, og neutraliser med dyrkningsmedie, hvis det er nødvendigt
Overfør cellesuspensionen til et 50 mL Falcon-rør

For suspenderede celler:

Tjek celletæthed og sundhed under et mikroskop
Overfør cellesuspensionen direkte til et 50 ml Falcon-rør

Celletælling og centrifugering

Tæl cellerne med et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller
Centrifugér ved 300 g i 3-5 minutter ved stuetemperatur for at pelleterer cellerne
Aspirer supernatanten forsigtigt, og undgå at forstyrre cellepelleten
Opvarm det forberedte frysemedie til 37 °C før brug

Kryopræservering

Resuspender cellepellet i frysemedie til en tæthed på 2,0 millioner celler/mL for adhærente celler og 5 millioner celler/mL for suspensionsceller eller den ønskede koncentration
Alikvotér 1,0 ml (eller mere efter behov) af cellesuspensionen til mærkede kryovialer
Brug en langsom nedfrysningsmetode, før du overfører cellerne til langtidsopbevaring

? Metode	? Skridt
❄️ Manuel nedfrysning	1️⃣ Placer celler i frysemedium i en fryser på 4 °C i 40 minutter. 2️⃣ Overfør til en fryser på -80 °C i 24 timer. 3️⃣ Opbevar cellerne i flydende nitrogen til langtidsopbevaring
? Brug af Mr. Frosty	1️⃣ Forbered celler i kryovialer med frysemedium. 2️⃣ Placer kryovials i Mr. Frosty-beholderen. 3️⃣ Opbevar ved -80 °C i 24 timer, før de overføres til flydende nitrogen
? Fryser med kontrolleret hastighed	1️⃣ Programmer enheden til gradvist at sænke temperaturen. 2️⃣ Placer de forberedte celler i fryseren. 3️⃣ Efter frysecyklussen overføres cellerne til flydende nitrogen

Opbevar kryovialerne ved temperaturer under -130 °C eller i flydende kvælstof til langtidsopbevaring.

Materialer og reagenser

1-2 mL kryovialer
CoolCell® fryseenhed eller fryser med kontrolleret hastighed
Kryobeskyttende frysemedium (f.eks. DIY-kryobeskyttende medier, CM-1, CM-ACF eller specialiserede medier)
Føtalt kvægserum (FBS) eller konditionerede medier
DMSO eller glycerol
Calcium- og magnesiumfri PBS
Accutase, Trypsin eller Trypsin-EDTA (til klæbende celler)
15 mL eller 50 mL Falcon-rør
Hæmocytometer eller automatiseret celletæller
Centrifuge