HuH7-celler: En indgang til forskning i leverkræft og HCV

HuH7-cellelinjen, der stammer fra humant hepatom, repræsenterer en immortaliseret samling af tumorigeniske epitel-lignende celler. Denne linje fungerer sammen med dens derivater HuH7.5 og HuH7.5.1 som en praktisk erstatning for primære hepatocytter i eksperimentelle sammenhænge. Den anvendes hovedsageligt i cellekulturmodeller til at undersøge hepatitis C-virus (HCV)-infektion og hepatom-patofysiologi.

Oprindelse og egenskaber ved HuH7-celler

Det er vigtigt at forstå HuH7-cellelinjens oprindelse, nøgleegenskaber og optimale dyrkningsbetingelser, inden den anvendes i forskning.

HuH7-cellelinjen blev etableret af Sato, J, og Nakabayshi, H i 1982 og stammer fra en højt differentieret hepatocytkræftstamme. Den stammer oprindeligt fra hepatocellulært karcinom hos en 57-årig japansk mand. HuH7-celler er kendetegnet ved deres evne til at producere forskellige fysiologisk relevante stoffer, såsom albumin og alfa-fetoprotein, og udviser en høj modtagelighed for HCV-infektion, hvilket gør dem velegnede til brug i HCV-replikonsystemer. Denne egenskab gør cellelinjen værdifuld til screening og udvikling af anti-HCV-terapier. HuH7-celler udviser en epitel-lignende morfologi med en sekskantet form og klæber sig til overflader for at danne 2D-monolag under vækst. I gennemsnit har HuH7-celler en diameter på 21,9 µm og har tendens til at fremstå større og fladere. HuH7-cellelinjen er kendetegnet ved et heterogent kromosomantal, der typisk ligger mellem 55 og 63, hvilket afspejler den genetiske variation inden for cellepopulationen. Denne heterogenitet er en konsekvens af det selektive pres, der opstår under cellekulturen, og kan variere under forskellige laboratorieforhold.

Sammenlignende analyse: HuH7 vs. HuH7.5-cellelinjer

HuH7.5-cellelinjen, der er en afart af HuH7, adskiller sig primært på grund af en missense-mutation i RIG-I (DDX58)-genet, som er afgørende for den intracellulære antivirale respons. Denne mutation øger HuH7.5-cellernes modtagelighed for replikation af genomisk og subgenomisk HCV-RNA, hvilket adskiller den fra den oprindelige HuH7-cellelinje med hensyn til dens anvendelighed i virologisk forskning.

Dyrkning af HuH7-celler: Vigtige protokoller for optimal vækst

HuH7-celler, der er en integreret del af utallige forskningsstudier, kræver præcise dyrkningsbetingelser for at trives. Dette afsnit dykker ned i de grundlæggende aspekter af HuH7-cellekulturer og sikrer, at deres fysiologiske relevans opretholdes i videnskabelige undersøgelser.

Dynamik i fordoblingstid

Fordoblingstiden for HuH7-celler er typisk 24 timer, selvom variationer i cellekulturmedier kan forlænge denne periode til 36-48 timer, hvilket understreger miljøforholdenes indflydelse på celleproliferationen.

Adhæsionsegenskaber

HuH7-celler danner overvejende et todimensionelt monolag, der klæber sig til overfladerne på dyrkningsplader og kolber, hvilket understreger deres præference for et stabilt fysisk substrat frem for suspensionskulturer.

Optimal udsåningstæthed

Det er afgørende at opretholde HuH7-cellernes konfluens inden for intervallet 30-90 % for at forhindre et fald i proliferationshastighederne ud over 90 % konfluens. Subkultivering med accutase letter løsrivelsen, hvilket muliggør udsåning ved tætheder, der er tilpasset de eksperimentelle behov, fra optimale niveauer (2×10⁴ celler/cm²) til mætningsniveauer (6×10⁴ celler/cm²).

Ernæringsbehov

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) med højt glukoseindhold og tilsat 10 % føtal bovint serum (FBS) giver et ideelt ernæringsmiljø for HuH7-celler. Regelmæssig udskiftning af mediet, helst 2-3 gange om ugen, er afgørende for vedvarende cellehelbred.

Miljøforhold

En befugtet inkubator indstillet til 5 % CO₂ og 37 °C understøtter HuH7-cellekulturen optimalt og simulerer fysiologiske betingelser, der fremmer celleaktiviteter.

Langtidsopbevaring

For længerevarende opbevaring bør HuH7-celler opbevares i dampfasen af flydende nitrogen, hvilket sikrer deres levedygtighed til fremtidig forskning.

Kryopræservering og genopretning

Anvendelse af en gradvis fryseteknik er afgørende for at opretholde cellernes levedygtighed under kryopræservering. Cellerne bør suspenderes i et specielt udviklet frysemedium, såsom CM-1, for at sikre en jævn overgang til kryogen opbevaring. Efter optøning er en hurtig, men skånsom genoplivning i et 37 °C varmt vandbad, efterfulgt af centrifugering for at fjerne frysemediet og resuspension i frisk vækstmedium, afgørende for at genoprette cellekulturerne.

Overvejelser vedrørende biosikkerhed

Det anbefales at overholde en biosikkerhedsprotokol på niveau 1 ved håndtering og formering af HuH7-cellelinjen i overensstemmelse med sikkerheds- og etiske standarder i laboratoriemiljøer.

Ved at overholde disse omhyggeligt beskrevne dyrkningsbetingelser kan forskere sikre en robust vækst og fysiologisk relevans af HuH7-celler i deres videnskabelige undersøgelser, hvilket baner vejen for banebrydende opdagelser inden for forskning i leverkræft og hepatitis C-virus.

Udforsk HuH7-celler til dine videnskabelige gennembrud

HuH7-celler: Fordele og ulemper

HuH7-cellelinjen har både fordele og begrænsninger. Lad os gennemgå de potentielle fordele og ulemper ved denne cellelinje, da det kan hjælpe dig med at afgøre, om den er egnet til dine eksperimenter.

Fordele ved HuH7-cellelinjen

HuH7-celler har mange karakteristiske træk, der gør dem attraktive til forskningsbrug.

• Nem formering: I modsætning til andre humane hepatomcellelinjer kan HuH7-cellelinjen let dyrkes uden tilsætning af serum; CLS anbefaler dog at bruge RPMI 1640 med 10 % FBS og 2 mM L-glutamin. HuH-7-celler udskiller en vækstfaktor, der hjælper cellerne med at vokse uden serum.
• Fleksibilitet ved transfektion: HuH7-cellelinjen er meget udbredt til transfektionsformål på grund af dens høje modtagelighed over for HCV-genomet. Derfor er disse celler afgørende for screening og udvikling af anti-HCV-lægemidler.
• Alternativ til humane hepatocytter: HuH7-cellelinjen er en fremragende erstatning for humane hepatocytter. Den kan hjælpe forskere med at studere hepatiske lægemiddeltransportører og forstå interaktionen mellem visse lægemidler og MRP'er (multi-drug resistance-associated proteins).
• Udvikling af en xenotransplantationsmusemodel: HuH7-celler er blevet brugt til at fremstille en cellelinje-baseret xenotransplantationsmusemodel. Denne dyremodel kan give forskere værdifuld indsigt i proteinkinasehæmmere og kræftbehandlinger.
• Kræftforskning: HuH7-cellelinjen er en human leverkræftcellelinje, som hjælper forskere med at gennemføre leverkræftstudier.

Begrænsninger ved HuH-7-cellelinjen

Der er nogle begrænsninger forbundet med dyrkning af HuH7-cellelinjen.

Mikrobiel kontaminering: Bakteriel kontaminering er det mest almindelige problem i cellekulturer. Når der opstår en infektion, kan den skelnes ved hjælp af ændringer i pH-værdien og turbiditeten i dyrkningsmediet. Blandt bakterielle kontamineringer er mycoplasmakontaminering normalt ikke synlig. Den påvirker dog langsomt cellelinjens morfologi, genekspression og andre egenskaber.

Dyrkningsperiode: Selvom HuH7-cellelinjen er udødelig, kan overskridelse af dyrkningsperioden gradvist påvirke cellernes sundhed. Det kan påvirke proliferationshastigheden og genekspressionen, hvilket kan reducere resultaternes reproducerbarhed. For HuH7-cellelinjen bør antallet af passager holdes under 20–25.

Anvendelser af HuH-7-celler

Denne cellelinje, der stammer fra humant hepatom, har mange anvendelsesmuligheder inden for forskning. Her beskriver vi nogle få forskningsområder, hvor HuH7-cellelinjen anvendes.

1. Lægemiddelresistens: HuH7 er en hepatocellulær karcinom (HCC)-cellelinje, der kan bruges til at undersøge lægemiddelresistens over for potentielle behandlinger af leverkræft. I en undersøgelse fra 2021 blev der anvendt HuH7-celler, som eksperimentelt var gjort resistente over for sorafenib, til at udvikle nye og effektive lægemidler, nemlig mitokondrieakkumulerende selvmonterende peptider.

2. Genetiske indsigter og molekylær profilering gennem HuH7-celler: De forskellige HuH7-cellelinjer, herunder forskellige derivater og varianter, har muliggjort en dybere forståelse af genekspression og specifikke genomiske markørers rolle i sygdom. Teknikker såsom Raman-spektroskopi, som forskere som Evgeny Gladilin har været fortaler for, er blevet anvendt på HuH7-celler til molekylær og cellulær profilering, hvilket har givet indsigt i den cellulære respons på virusinfektion. Potentialet i Raman-spektroskopi, kombineret med metoder som kvantitativ proteomik, har lettet udforskningen af værtscellereaktioner, herunder interferonresponsen og ændringer i lipiddråber, som er afgørende for forståelsen af HCV-replikation og effekten af SARS. Udtrykket af forskellige onkogene markører kan undersøges for at forstå deres adfærd som reaktion på enhver behandling, såsom i en undersøgelse, der anvendte HuH7-celler til at undersøge effekten af Kaempferol-forbindelsen på ekspressionsmønsteret for MMP9- og AKT-signalvejsgener. Disse signalveje regulerer metastasering og invasivitet af hepatocellulært karcinom. En anden nylig undersøgelse undersøgte også rollen af Wnt/β-catenin-signalkaskadegenet i overlevelsen og væksten af HCC-celler.

3. Lægemiddeludvikling: HuH7-celler anvendes i vid udstrækning i lægemiddelscreening og udviklingsstudier mod leverkræft. Der er gennemført adskillige studier for at undersøge det hæmmende potentiale af mange planteekstrakter, plantebaserede forbindelser, nanopartikler og andre terapeutiske midler mod HCC. En undersøgelse gennemført i 2022 undersøgte de pro-apoptotiske og kræftbekæmpende egenskaber af et radionuklid mod hepatocellulært karcinom ved hjælp af en HuH7-cellelinje.

4. HuH7-celler: Et omdrejningspunkt i virusforskning og celleanalyse HuH7-celler er blevet en hjørnesten i studiet af virusinfektioner og smitsomme sygdomme, især hepatitis C-virus (HCV) og deres interaktioner med coronavira som SARS-CoV-2, der er ansvarlig for coronavirus-sygdommen 2019 (COVID-19). Udviklingen af eksperimentelle HCV-cellekultursystemer (HCVcc) ved hjælp af HuH7-celler har i væsentlig grad forbedret vores evne til at studere HCV's indviklede replikationsproces og værtsfaktorer, der er afgørende for HCV-infektion. Dette omfatter undersøgelse af effektiviteten af HCV-RNA-replikation og produktionen af infektiøse virioner. De forskellige linjer af HuH7-celler, herunder senescente og inficerede varianter, udgør et mangfoldigt panel til undersøgelse af infektionens mangfoldighed, viral spredning og hæmmingsmekanismer mod vira som SARS.

Sammenfattende omfatter studiet af HuH7-celler et bredt spektrum af videnskabelige undersøgelser, fra de molekylære mekanismer, der ligger til grund for virusinfektioner, til de detaljerede cellulære reaktioner, som disse patogener fremkalder. Gennem HuH7-forskningen fortsætter det videnskabelige samfund med at afdække den komplekse dynamik i interaktionerne mellem vært og virus, hvilket bidrager til fremskridt inden for antivirale strategier og vores forståelse af cellulære determinanter i virussygdomme.

HuH-7-publikationer

Der findes en lang række publikationer, der bruger HuH7-cellelinjen til forskellige formål. Her har vi nævnt et par nylige og vigtige publikationer.

• Anvendelse af selvmonterende peptider rettet mod mitokondrierne som en ny behandling af sorafenib-resistente hepatocellulære carcinomceller.

Denne undersøgelse blev offentliggjort i Nature Scientific Reports i 2021. Undersøgelsen anvendte eksperimentelt inducerede sorafenib-resistente hepatocellulære karcinomceller (HuH7-cellelinje) til at undersøge de pro-apoptotiske og antitumorvirkninger af det nyligt udviklede Mito-FF (mitochondrieakkumulerende selvmonterende peptider).

• Kaempferol hæmmer cellemigrationen af humane hepatocellulære karcinomceller ved at undertrykke MMP-9 og Akt-signalering

Denne artikel blev offentliggjort i tidsskriftet Environmental Toxicology af Po-Chung Ju og kolleger i 2021. I denne undersøgelse undersøgte forskerne det antimetastatiske potentiale af et plantebaseret stof, kaempferol, mod hepatocellulære karcinomceller (HuH7). Derudover studerede de også de signalveje, der regulerer metastasering og invasion af leverkræftceller.

• Daphnetin hæmmer overlevelsen af hepatocellulære karcinomceller gennem regulering af Wnt/β-catenin-signalvejen

Denne artikel blev offentliggjort i tidsskriftet Drug Development Research i 2022. Denne undersøgelse forklarer daphnetin-forbindelsens kræftbekæmpende rolle mod HCC. Denne plantebaserede forbindelse hæmmer Wnt/β-catenin-signalering for at begrænse kræftcellernes vækst.

• RGFP966 undertrykker tumorvækst og migration gennem hæmning af EGFR-ekspression i hepatocellulære karcinomceller in vitro

Denne forskningsartikel, der er offentliggjort i tidsskriftet Drug Design, Development, and Therapy, beskriver EGFR-signaleringens rolle i vækst og metastase af hepatocellulært karcinom. I undersøgelsen anvendtes HuH7-celler til at undersøge den hæmmende virkning af RGFP966, en histon-deacetylase 3 (HDAC3)-hæmmer, mod HCC via undertrykkelse af gener i EGFR-signalvejen.

• Rheniumperrhenat (188ReO4) inducerede apoptose og reducerede den kræftagtige fænotype i leverkræftceller

Denne publikation i tidsskriftet Cells beskriver brugen af HuH7-celler til at undersøge anti-HCC-potentialet af et radionuklid, nemlig rheniumperrhenat.

• Antiviral aktivitet af chitosan-nanopartikler, der indkapsler curcumin, mod hepatitis C-virus genotype 4a i humane hepatomcellelinjer

Denne undersøgelse er offentliggjort i International Journal of Nanomedicine. Undersøgelsen anvendte HuH7-celler til at undersøge den antivirale aktivitet af curcumin-holdige chitosan-nanopartikler mod HCV-genotype 4a.

HuH-7-ressourcer: Protokoller, videoer og mere

Der findes mange ressourcer til dyrkning og vedligeholdelse af HuH7-cellelinjer. Her kan du læse om de tilgængelige ressourcer, der forklarer protokoller for cellekultivering og transfektion af HuH7, samt se undervisningsvideoer.

Cellekulturprotokoller

Følgende ressourcer kan hjælpe dig med at komme i gang med dyrkning og vedligeholdelse af HuH7.

• HuH-7-cellekulturinfo og ressourcer: Denne hjemmeside indeholder en masse nyttig information, herunder subkultureringsprotokollen for HuH7-cellelinjen, dens opbevaring og håndtering.

• HuH7-cellekulturprotokol

Transfektionsprotokoller for HuH7

HuH7-celler transficeres på mange måder. Følgende ressourcer indeholder en masse information om transfektionsprotokoller, nødvendige reagenser og kemikalier, nyttige tips og forholdsregler.

Videoer vedrørende HuH7-cellelinjen

Der findes mange undervisningsvideoer om grundlæggende subkultivering, udpladning og transfektionsprotokoller m.m.

• Passering af celler: Grundlæggende om cellekultur: Denne video handler om den grundlæggende dyrkningsprotokol for cellelinjen.

Vi forventer, at oplysningerne i denne artikel vil hjælpe dig med at tilegne dig grundlæggende og avanceret viden om HuH7-cellelinjen, inden du arbejder med den. Hvis du ønsker at anvende disse celler i dit forskningsarbejde, kan du bestille dem hos os.

Ofte stillede spørgsmål om HuH7-cellelinjen og virusforskning