HaCaT-celler – undersøgelse af hudbiologi og hudsygdomme
HaCaT-celler stammer fra humane epidermale keratinocytter og bruges ofte til at udforske epidermal homeostase og tilknyttede patologier. Disse celler betragtes som spontant immortaliserede humane keratinocytter, hvilket er bemærkelsesværdigt, da de stammer fra normale hudkeratinocytter uden at have været udsat for krise eller væksthæmning. Denne unikke oprindelse giver HaCaT-celler en række genetiske og vækstegenskaber, der adskiller sig fra andre cellelinjer. På trods af at de udviser en transformeret fænotype in vitro med klonogene egenskaber på agar eller plast, forbliver HaCaT-cellelinjen ikke-tumorigen. Som den første stabile epitelcellelinje fra voksen menneskehud, der udviser normal differentiering, er HaCaT-celler et værdifuldt redskab til at undersøge reguleringen af keratinisering i menneskelige celler. Disse celler har en bred vifte af anvendelsesmuligheder på grund af deres evne til at proliferere og differentiere effektivt in vitro.
- Vækstmedium
- Se produktsiden
- Fordoblingstid
- Se produktsiden
- Væksttype
- Adhærent
- Biosikkerhedsniveau
- BSL-1
- Fås hos
- Cytion — Bestil HaCaT
- Karakteristika ved HaCaT-celler
- Genetiske egenskaber og oprindelse af HaCaT-celler
- Sådan høstes HaCaT-celler i 5 enkle trin
- Anvendelser af HaCaT-celler
- Udvalgte videoer: Udforsk HaCaT-cellernes verden
Egenskaber ved HaCaT-celler
HaCaT-celler kan dyrkes under betingelser med lavt calciumindhold og har et spindelformet udseende uden tætte forbindelser mellem cellerne, ligesom primære celler, der opbevares under de samme betingelser. I den normale epidermis udvikler keratinocytter sig fra stamceller i basallaget og bevæger sig gennem spinous- og granulærlagene, før de når hornhindelaget og afstødes til omgivelserne. Denne nøje regulerede balance mellem proliferation og afskalning resulterer i fuldstændig fornyelse eller forandring hver 28. dag, en kompleks proces kendt som keratinisering. Denne proces er stærkt reguleret og involverer markante ændringer i genekspression, strukturelt design og enzymatisk aktivitet. Til in vitro- og in vivo-analyse skal HaCaT-celler opretholde de epidermale keratiner, der er karakteristiske for de differentierede lag af humane epidermisceller, og som er afgørende for at opretholde hudens strukturelle integritet og modstandsdygtighed. Selvom der kan forekomme sekventielle kromosomale ændringer i HaCaT-celler, er disse muligvis ikke forbundet med væsentlige differentieringsproblemer, men viser i stedet den spontane transformation af humane voksne keratinocytter in vitro.
Genetiske egenskaber og oprindelse af HaCaT-celler
HaCaT-celler er en spontant udødeliggjort human keratinocytcellelinje, der stammer fra voksen hud og repræsenterer en unik evolutionær udviklingsvej. Disse celler har mutationer i begge alleler af p53-genet, hvilket er typisk for mutationer induceret af UV-stråling [3,4]. Derudover antages HaCaT-celler at være opstået ved mutationer i p53-tumorsuppressorgenet, efterfulgt af tabet af senescensgener [5].
Tumorsuppressorgenet p53, der er kendt for sin rolle i DNA-reparation og som genomets vogter, inducerer den menneskelige huds reaktion på DNA-skader [4]. Det er blevet observeret, at HaCaT-celler delvist har mistet deres beskyttelsesmekanisme mod DNA-skader på grund af in vivo-mutationen af p53-genet, hvilket gør dem modtagelige for akkumulerende cytogenetiske ændringer som reaktion på forhøjede dyrkningstemperaturer. En anden mekanisme til at gøre HaCaT-celler udødelige involverer øget telomeraseenzymaktivitet [7]. I normale celler forkortes telomererne kontinuerligt med hver celledeling, indtil cellulær senescens nås. Telomerase er et specialiseret cellulært enzymkompleks med revers transkriptaseaktivitet, der opretholder en stabil telomerlængde. I modsætning hertil viser HaCaT-celler en signifikant øget telomeraseaktivitet, hvilket resulterer i en velbevaret telomerlængde. Disse observationer bekræfter telomerases rolle i udødeliggørelsesprocessen af HaCaT-celler.
Der er identificeret tre specifikke kromosomale translokationer, der resulterer i tab af en kopi af kromosomarmene 3p, 4p og 9p, en gevinst af 9q og dannelse af isokromosomer. Tabet af den korte arm af kromosom 3p kan føre til tab af senescensgener og udødeliggørelsen af HaCaT-celler [8]. HaCaT-celler er hypodiploide og besidder tydelige og stabile markørkromosomer, der repræsenterer deres monoklonale oprindelse. Karakteristikaene og oprindelsen af HaCaT-cellelinjen blev bekræftet ved hjælp af DNA-fingeraftryk med hypervariable minisatellitmarkører [3-6].
Sådan høstes HaCaT-celler i 5 enkle trin
- Fjern dyrkningsmediet og skyl de vedhæftede celler med 3-5 ml PBS uden calcium og magnesium til T25-kolber eller 5-10 ml til T75-kolber.
- Tilsæt 1-2 ml friskfremstillet 0,05 % EDTA-opløsning pr. T25-kolbe eller 2,5 ml pr. T75-kolbe, og sørg for, at hele cellearket er dækket, og inkuber ved 37 °C i 10 minutter.
- Tilsæt 1 ml friskfremstillet trypsin/EDTA-opløsning (0,05 %/0,025 %) pr. T25-kolbe eller 2,5 ml pr. T75-kolbe, og sørg igen for, at hele cellearket er dækket. Cellerne bør løsne sig inden for 1-2 minutter.
- Stop trypsinaktiviteten ved at tilsætte et FBS-holdigt cellekulturmedium.
- Overfør cellerne til nye kolber indeholdende frisk cellekulturmedium.
Anvendelser af HaCaT-celler
HaCaT-celler er et værdifuldt redskab til at studere keratinocytter [9]. Disse udødelige celler fungerer som preneoplastiske celler og kan give indsigt i ændringer, der er involveret i malign og neoplastisk transformation [10]. Monolags HaCaT-cellekulturer er essentielle til anvendelser inden for cellulær toksicitet og in vitro-analyse af sårheling. HaCaT-celler kan også bruges til at vurdere hudtoksicitet forårsaget af forskellige agenser og neoplastiske eller inflammatoriske processer. De kan anvendes til at analysere forskellige mekanismer bag kutane allergiske reaktioner, virkningerne af reaktive iltarter og bestråling med UV. Ved stimulering kan HaCaT-celler differentiere sig og udtrykke specifikke differentieringsmarkører, såsom involucrin, K14 og K10. HaCaT-celler bruges også ofte som model til at studere patofysiologien af epidermal homeostase [6].
HaCaT-celler bevarer deres evne til at danne en struktureret epidermis in vivo efter transplantation, hvilket resulterer i en lagdelt epidermisstruktur, der kan skifte mellem en basal og en differentieret tilstand ved ændringer i calciumkoncentrationen i mediet. Disse celler muliggør også karakterisering af flere biologiske processer, såsom deres anvendelse som et vitamin D-modelsystem og stofskiftet i huden. Da HaCaT-celler ikke er genetisk manipulerede, giver de et objektivt billede af det brede spektrum af indledende genetiske begivenheder i menneskets hud.
Udvalgte videoer: En rejse ind i HaCaT-cellernes verden
"HaCaT-cellemigration": Denne video viser processen med cellemigration i HaCaT-celler. Cellemigration er en afgørende proces for forskellige biologiske processer, såsom sårheling og kræftmetastaser. Videoen viser HaCaT-cellernes bevægelse under et mikroskop og giver et visuelt indblik i, hvordan disse celler migrerer. Cellernes aktivitet observeres, mens de bevæger sig fra et sted til et andet, og videoen giver en tydelig illustration af de forandringer, der sker i cellerne under denne proces.
"Scratch-assay udført på HaCaT-celler": Denne video viser et scratch-assay udført på HaCaT-celler. Scratch-assayet er en udbredt teknik til at studere cellemigration, og i dette tilfælde bruges den til at analysere migrationen af HaCaT-celler. Videoen demonstrerer processen med at lave en rids på overfladen af en cellekulturskål, som derefter observeres under et mikroskop, mens HaCaT-cellerne migrerer og lukker hullet over tid.
"Cellevækst af HaCaT-keratinocytter til sårhelingseksperimenter": Denne video demonstrerer processen med cellevækst af HaCaT-keratinocytter til sårhelingseksperimenter. HaCaT-keratinocytter er en almindeligt anvendt cellelinje i sårhelingsstudier.
"HaCaT-celle differentiering": Denne video viser de nødvendige trin til differentiering af HaCaT-celler. HaCaT-celler kan differentieres til forskellige typer hudceller. Videoen demonstrerer ændringerne i HaCaT-celler, når de differentieres, og viser visuelt de forskellige markører og karakteristika ved differentieringen. Differensieringsprocessen er afgørende for normal hudfunktion, og videoen fremhæver de forskellige stadier af differentiering, som HaCaT-celler gennemgår.
Referencer
- Angel P og Karin M: Jun, Fos og AP-1-kompleksets rolle i celleproliferation og -transformation. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Reguleringen af epidermal hyperplastisk vækst. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolering og karakterisering af en spontant opstået langlivet linje af humane keratinocytter (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53-mutationer i humane udødeliggjorte epitelcellelinjer. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutationshotspots forårsaget af sollys i p53-genet ved ikke-melanom hudkræft. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Flere stadier og genetiske ændringer i udødeliggørelse, malign transformation og tumorprogression af humane hudkeratinocytter. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomeraseaktivitet i det regenerative basallag af epidermis i menneskelig hud og i udødelige og karcinomafledte hudkeratinocytter. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT-celler som en pålidelig in vitro-differentieringsmodel til at analysere den inflammatoriske/reparative respons hos humane keratinocytter. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. et al. Normal keratinisering i en spontant udødeliggjort aneuploid human keratinocytcellelinje. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
- Gibbs, Graham: Analyse af kvalitative data. The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Anvendt forskningsdesign: en praktisk guide. Sage: London
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinisering i en spontant udødeliggjort aneuploid human keratinocytcellelinje. Cell Biol. (1988);106:761–771.