HaCaT-celler - udforskning af hudens biologi og sygdom
HaCaT-celler stammer fra humane epidermale keratinocytter og bruges ofte til at udforske epidermal homeostase og tilknyttede patologier. Disse celler betragtes som spontant udødeliggjorte humane keratinocytter, hvilket er bemærkelsesværdigt, fordi de stammer fra normale hudkeratinocytter uden krise eller væksthæmning. Denne unikke oprindelse giver HaCaT-celler et sæt genetiske og vækstmæssige egenskaber, der adskiller sig fra andre cellelinjer. På trods af at HaCaT-cellelinjen udviser en transformeret fænotype in vitro med klonogene egenskaber på agar eller plastik, forbliver den ikke-tumorigen. Som den første stabile epitelcellelinje fra voksen menneskehud, der udviser normal differentiering, er HaCaT-celler et værdifuldt værktøj til at undersøge reguleringen af keratinisering i menneskeceller. Disse celler har en bred vifte af anvendelsesmuligheder på grund af deres evne til at sprede sig og differentiere sig effektivt in vitro.
- Karakteristika for HaCaT-celler
- HaCaT-cellers genetiske egenskaber og oprindelse
- Sådan høster du HaCaT-celler i 5 enkle trin
- Anvendelser af HaCaT-celler
- Udvalgte videoer: Udforskning af HaCaT-cellernes verden
1.karakteristika for HaCaT-celler
HaCaT-celler kan dyrkes under forhold med lavt calciumindhold og har et spindelformet udseende, der mangler tætsluttende forbindelser mellem cellerne, ligesom primære celler, der vedligeholdes under de samme forhold. I den normale epidermis udvikler keratinocytter sig fra stamceller i det basale lag og bevæger sig gennem de spinøse og granulære lag, før de når hornhindelaget og afskalker til omgivelserne. Denne nøje regulerede balance mellem proliferation og afskalning resulterer i fuldstændig fornyelse eller forandring hver 28. dag, en kompleks proces kendt som keratinisering. Denne proces er stærkt reguleret og involverer markante ændringer i genekspression, strukturelt design og enzymatisk aktivitet. Til in vitro- og in vivo-analyse skal HaCaT-celler opretholde de epidermale keratiner, der er karakteristiske for de differentierede lag af humane epidermisceller, som er afgørende for at opretholde hudens strukturelle integritet og modstandsdygtighed. Selvom sekventielle kromosomforandringer kan forekomme i HaCaT-celler, er de muligvis ikke forbundet med væsentlige differentieringsproblemer og viser i stedet den spontane transformation af humane voksne keratinocytter in vitro.
2.haCaT-cellernes genetiske karakteristika og oprindelse
HaCaT-celler er en spontant udødeliggjort human keratinocytcellelinje, der stammer fra voksen hud og repræsenterer en unik evolutionær vej. Disse celler har mutationer i begge alleler af p53-genet, hvilket er typisk for mutationer induceret af UV-stråling [3,4]. Derudover antages HaCaT-celler at være blevet genereret af mutationer i p53-tumorsuppressorgenet efterfulgt af tab af senescensgener [5].
Tumorsuppressorgenet p53, der er kendt for sin rolle i DNA-reparation og som arvemassens vogter, inducerer den menneskelige huds reaktion på DNA-skader [4]. Det er blevet observeret, at HaCaT-celler delvist har mistet deres beskyttelsesmekanisme mod DNA-skader på grund af in vivo-mutationen af p53-genet, hvilket gør dem modtagelige for at akkumulere cytogenetiske ændringer som reaktion på forhøjede dyrkningstemperaturer. En anden mekanisme til udødeliggørelse af HaCaT-celler involverer øget telomerase-enzymaktivitet [7]. I normale celler forkortes telomererne løbende med hver celledeling, indtil cellulær senescens er nået. Telomerase er et specialiseret cellulært enzymkompleks med revers transkriptaseaktivitet, der opretholder en stabil telomerlængde. I modsætning hertil viser HaCaT-celler markant øget telomeraseaktivitet, hvilket resulterer i en velholdt telomerlængde. Disse observationer bekræfter telomerasens rolle i udødeliggørelsesprocessen af HaCaT-celler.
Der er identificeret tre specifikke kromosomtranslokationer, som resulterer i tab af en kopi af kromosomarmene 3p, 4p og 9p, en gevinst af 9q og isokromosomdannelse. Tabet af den korte arm af kromosom 3p kan føre til tab af senescensgener og udødeliggørelse af HaCaT-celler [8]. HaCaT-celler er hypodiploide og har tydelige og stabile markørkromosomer, der repræsenterer deres monoklonale oprindelse. HaCaT-cellelinjens egenskaber og hoved blev bekræftet ved hjælp af DNA-fingeraftryk med hypervariable minisatellitmarkører [3-6].
3.sådan høster du HaCaT-celler i 5 enkle trin
- Fjern dyrkningsmediet, og skyl de klæbende celler med 3-5 ml PBS uden calcium og magnesium til T25-kolber eller 5-10 ml til T75-kolber.
- Tilsæt 1-2 ml frisklavet 0,05 % EDTA-opløsning pr. T25-kolbe eller 2,5 ml pr. T75-kolbe, og sørg for, at hele cellepladen er dækket, og inkuber ved 37 °C i 10 minutter.
- Tilsæt 1 ml frisklavet trypsin/EDTA-opløsning (0,05 %/0,025 %) pr. T25-kolbe eller 2,5 ml pr. T75-kolbe, og sørg igen for, at hele cellearket er dækket. Cellerne bør løsne sig inden for 1-2 minutter.
- Stop trypsinaktiviteten ved at tilsætte et FBS-holdigt cellekulturmedium.
- Fordel cellerne i nye kolber, der indeholder frisk cellekulturmedium.
4. Anvendelser af HaCaT-celler
HaCaT-celler er et værdifuldt værktøj til at studere keratinocytter [9]. Disse udødelige celler fungerer som præneoplastiske celler og kan give indsigt i ændringer, der er involveret i malign og neoplastisk transformation [10]. HaCaT-cellekulturer i monolag er afgørende for analyser af celletoksicitet og in vitro-sårheling. HaCaT-celler kan også bruges til at vurdere hudtoksicitet forårsaget af forskellige stoffer og neoplastiske eller inflammatoriske processer. De kan bruges til at analysere forskellige mekanismer i kutane allergiske reaktioner, virkningerne af reaktive oxygenarter og UV-bestråling. Efter stimulering kan HaCaT-celler differentiere sig og udtrykke specifikke differentieringsmarkører som involucrin, K14 og K10. HaCaT-celler bruges også ofte som en model til at studere patofysiologien i epidermal homeostase [6].
HaCaT-celler bevarer deres evne til at rekonstruere en struktureret epidermis in vivo efter transplantation, hvilket resulterer i en stratificeret epidermal struktur, der kan vendes mellem en basal og differentieret tilstand ved ændringer i calciumkoncentrationen i mediet. Disse celler gør det også muligt at karakterisere flere biologiske processer, f.eks. deres anvendelse som et D-vitamin-modelsystem og metabolisme i huden. Da HaCaT-celler ikke er genetisk manipulerede, giver de et upartisk billede af det brede spektrum af oprindelige genetiske begivenheder i menneskehud.
5. Udvalgte videoer: Udforsk HaCaT-cellernes verden
"HaCaT-cellernes migration": Denne video viser processen med cellemigration i HaCaT-celler. Cellemigration er en vigtig proces for forskellige biologiske processer, f.eks. sårheling og kræftmetastase. Videoen demonstrerer HaCaT-cellers bevægelse under et mikroskop og giver en visuel fremstilling af, hvordan disse celler migrerer. Cellernes aktivitet observeres, når de bevæger sig fra et sted til et andet, og videoen giver en klar illustration af de ændringer, der sker i cellerne under denne proces.
"Scratch Assay udført på HaCaT-celler": Denne video viser et Scratch Assay udført på HaCaT-celler. Scratch Assay er en meget anvendt teknik til at studere cellemigration, og i dette tilfælde bruges den til at analysere HaCaT-cellers migration. Videoen demonstrerer processen med at lave en ridse på overfladen af en cellekulturskål, som derefter observeres under et mikroskop, mens HaCaT-celler migrerer og lukker hullet over tid.
"Cellevækst af HaCaT-keratinocytter til sårhelingseksperimenter": Denne video demonstrerer processen med cellevækst af HaCaT-keratinocytter til sårhelingseksperimenter. HaCaT-keratinocytter er en almindeligt anvendt cellelinje i sårhelingsundersøgelser.
"HaCaT-celledifferentiering": Denne video viser de nødvendige trin til at differentiere HaCaT-celler. HaCaT-celler kan differentieres til forskellige typer hudceller. Videoen viser ændringerne i HaCaT-celler, når de differentieres, og repræsenterer visuelt de forskellige markører og karakteristika for differentiering. Differentieringsprocessen er afgørende for hudens normale funktion, og videoen fremhæver de forskellige stadier af differentiering, som HaCaT-cellerne gennemgår.
Referencer
- Angel P og Karin M: Jun, Fos og AP-1-kompleksets rolle i celleproliferation og -transformation. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomeraseaktivitet i det regenerative basale lag af epidermis i menneskehud og i udødelige og karcinom-afledte hudkeratinocytter. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT-celler som en pålidelig in vitro-differentieringsmodel til at dissekere den inflammatoriske/reparative respons hos humane keratinocytter. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. et al. Normal keratinisering i en spontant udødeliggjort aneuploid human keratinocytcellelinje. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
- Gibbs, Graham: Analyse af kvalitative data. The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Anvendt forskningsdesign: en praktisk guide. Sage: London
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinisering i en spontant immortaliseret aneuploid human keratinocytcellelinje. Cell Biol.(1988);106:761-771.