Buňky HuH7: Brána k výzkumu hepatomu a HCV

Buněčná linie HuH7, odvozená z lidského hepatomu, představuje imortalizovaný soubor nádorových epiteliálních buněk. Tato linie spolu se svými deriváty HuH7.5 a HuH7.5.1 slouží jako praktická náhrada primárních hepatocytů v experimentálním kontextu. Převážně se využívá v modelech buněčných kultur ke zkoumání infekce virem hepatitidy C (HCV) a patofyziologie hepatomů.

Původ a charakteristika buněk HuH7

Před použitím buněčné linie HuH7 ve výzkumu je nezbytné pochopit její původ, klíčové vlastnosti a optimální kultivační podmínky.

Buněčnou linii HuH7 založili Sato, J a Nakabayshi, H v roce 1982 a byla odvozena z vysoce diferencované nádorové linie hepatocytů. Původně pocházela z hepatocelulárního karcinomu u 57letého japonského muže. Buňky HuH7 se vyznačují schopností produkovat různé fyziologicky relevantní látky, jako je albumin a alfa-fetoprotein, a vykazují vysokou citlivost k infekci HCV, takže jsou vhodné pro použití v replikonových systémech HCV. Tato vlastnost činí buněčnou linii cennou pro screening a vývoj anti-HCV terapeutik. Buňky HuH7 vykazují morfologii podobnou epitelu, mají hexagonální tvar a během růstu přilnou k povrchu a vytvářejí 2D monovrstvy.průměrně majíbuňky HuH7 průměr 21,9 µm, přičemž mají tendenci k většímu, zploštělému vzhledu. Buněčná linie HuH7 se vyznačuje heterogenním počtem chromozomů, který se obvykle pohybuje mezi 55 a 63, což odráží genetickou variabilitu v rámci buněčné populace. Tato heterogenita je důsledkem selekčních tlaků, ke kterým dochází při kultivaci buněk, a může se lišit v různých laboratorních podmínkách.

Srovnávací analýza: buněčné linie HuH7 vs. HuH7.5

Buněčná linie HuH7.5, derivát HuH7, se liší především chybějící mutací v genu RIG-I (DDX58), který je klíčový pro intracelulární protivirovou odpověď. Tato mutace zvyšuje permisivitu buněk HuH7.5 pro replikaci genomické a subgenomické HCV RNA, čímž se odlišuje od mateřské buněčné linie HuH7 z hlediska její využitelnosti ve virologickém výzkumu.

Kultivace buněk HuH7: Základní protokoly pro optimální růst

Buňky HuH7, které jsou nedílnou součástí nesčetných výzkumných studií, vyžadují přesné kultivační podmínky, aby se jim dařilo. Tato část se zabývá základními aspekty kultivace buněk HuH7, které zajišťují zachování jejich fyziologického významu ve vědeckých výzkumech.

Dynamika doby zdvojení

Doba zdvojení buněk HuH7 je obvykle 24 hodin, ačkoli rozdíly v kultivačních médiích mohou tuto dobu prodloužit na 36-48 hodin, což poukazuje na vliv podmínek prostředí na buněčnou proliferaci.

Adhezní charakteristiky

Buňky HuH7 tvoří převážně dvourozměrnou monovrstvu, která přiléhá k povrchu kultivačních desek a baněk, což podtrhuje jejich preferenci stabilního fyzického substrátu před suspenzními kulturami.

Optimální hustota výsevu

Udržování konfluence buněk HuH7 v rozmezí 30-90 % je rozhodující, aby se zabránilo poklesu míry proliferace nad 90 % konfluence. Subkultivace s akutázou usnadňuje oddělování, což umožňuje výsev v hustotě přizpůsobené experimentálním potřebám, od optimální (2×10⁴ buněk/cm²) až po saturační (6×10⁴ buněk/cm²).

Nutriční požadavky

Dulbeccovo modifikované orlí médium (DMEM) s vysokým obsahem glukózy a doplněné 10 % fetálního hovězího séra (FBS) poskytuje ideální nutriční prostředí pro buňky HuH7. Pravidelná obnova média, ideálně 2 až 3krát týdně, je zásadní pro trvalé zdraví buněk.

Podmínky prostředí

Zvlhčený inkubátor nastavený na 5 % CO₂ a 37 °C optimálně podporuje kultivaci buněk HuH7 a simuluje fyziologické podmínky příznivé pro buněčné aktivity.

Dlouhodobé skladování

Pro delší uchování by měly být buňky HuH7 skladovány v plynné fázi kapalného dusíku, čímž se zajistí jejich životaschopnost pro budoucí výzkum.

Kryokonzervace a obnovení

Pro zachování životaschopnosti buněk během kryokonzervace je nejdůležitější použít techniku postupného zmrazování. Buňky by měly být suspendovány ve speciálně navrženém mrazicím médiu, jako je CM-1, což zajistí plynulý přechod ke kryogennímu skladování. Po rozmrazení je pro obnovení buněčných kultur nezbytné rychlé, ale šetrné oživení ve vodní lázni o teplotě 37 °C, následované odstředěním, aby se odstranilo mrazicí médium, a resuspenze v čerstvém růstovém médiu.

Úvahy o biologické bezpečnosti

Při manipulaci s buněčnou linií HuH7 a jejím množení se doporučuje dodržovat protokol úrovně biologické bezpečnosti 1, který odpovídá bezpečnostním a etickým normám v laboratorních podmínkách.

Dodržováním těchto pečlivě popsaných kultivačních podmínek mohou výzkumní pracovníci zajistit robustní růst a fyziologickou relevanci buněk HuH7 ve svých vědeckých výzkumech a připravit tak půdu pro převratné objevy v oblasti výzkumu hepatomu a viru hepatitidy C.

Prozkoumejte buňky HuH7 pro své vědecké objevy

Buňky HuH7: Výhody a nevýhody

Buněčná linie HuH7 nabízí výhody i omezení zároveň. Projděme si potenciální výhody a nevýhody této buněčné linie, protože vám to může pomoci při rozhodování, zda je vhodná pro vaše experimenty.

Výhody buněčné linie HuH7

Buňky HuH7 mají mnoho charakteristických vlastností, které je činí atraktivními pro výzkumné použití.

• Snadné množení: Na rozdíl od jiných lidských hepatomových buněčných linií lze buněčnou linii HuH7 snadno pěstovat bez přídavku séra; CLS však doporučuje používat RPMI 1640 s 10 % FBS a 2 mM L-glutaminem. Buňky HuH-7 vylučují růstový faktor, který pomáhá buňkám růst bez séra.
• Flexibilita transfekce: Buněčná linieHuH7 je široce používána pro účely transfekce díky své vysoké vnímavosti vůči genomu HCV. Proto jsou tyto buňky klíčové pro screening a vývoj léků proti HCV.
• Alternativa lidských hepatocytů: Buněčná linie HuH7 je vynikající náhradou lidských hepatocytů. Může vědcům pomoci při studiu jaterních přenašečů léčiv a při pochopení interakce některých léčiv s MRP (multi-drug resistance-associated proteins).
• Vývoj myšího xenograftového modelu: Buňky HuH7 byly použity k vytvoření xenotransplantačního myšího modelu vytvořeného z buněčných linií. Tento zvířecí model může výzkumným pracovníkům poskytnout cenné poznatky o inhibitorech proteinkináz a protinádorových terapiích.
• Výzkum rakoviny: Buněčná linie HuH7 je lidská buněčná linie rakoviny jater, která pomáhá vědcům provádět studie rakoviny jater.

Omezení buněčné linie HuH-7

S kultivací buněčné linie HuH7 jsou spojena některá omezení.

Mikrobiální kontaminace: Bakteriální kontaminace je nejčastějším problémem při kultivaci buněk. Když dojde k infekci, lze ji rozeznat podle změny pH a zákalu kultivačního média. Mezi bakteriální kontaminací se obvykle neprojevuje kontaminace mykoplasmou. Pomalu však ovlivňuje morfologii, genovou expresi a další vlastnosti buněčné linie.

Doba kultivace: Přestože je buněčná linie HuH7 nesmrtelná, překročení doby kultivace může postupně ovlivnit zdraví buněk. Může ovlivnit rychlost proliferace a genovou expresi, což může snížit reprodukovatelnost výsledků. U buněčné linie HuH7 by se počet pasáží měl udržovat pod 20-25.

Aplikace buněk HuH-7

Tato buněčná linie odvozená od lidského hepatomu nabízí mnoho výzkumných aplikací. Zde popisujeme několik oblastí výzkumu využívajících buněčnou linii HuH7.

1. Rezistence vůči lékům: HuH7 je buněčná linie hepatocelulárního karcinomu (HCC), kterou lze použít ke studiu rezistence na léky proti potenciální léčbě rakoviny jater. Studie provedená v roce 2021 použila buňky HuH7, které byly experimentálně učiněny rezistentními vůči sorafenibu, k vývoji nových a účinných terapeutik, tj. mitochondrie akumulujících samoskladných peptidů.

2. Genetické poznatky a molekulární profilování prostřednictvím buněk HuH7: Odlišné buněčné linie HuH7, včetně různých derivátů a variant, umožnily hlubší pochopení genové exprese a úlohy specifických genomických markerů v onemocnění. Techniky, jako je Ramanova spektroskopie, kterou prosazují výzkumníci jako Evgeny Gladilin, byly použity na buňkách HuH7 pro molekulární a buněčné profilování, což odhalilo vhled do buněčné odpovědi na virovou infekci. Potenciál Ramanovy spektroskopie v kombinaci s metodami, jako je kvantitativní proteomika, usnadnil zkoumání reakcí hostitelských buněk, včetně interferonové odpovědi a změn v lipidových kapénkách, které jsou rozhodující pro pochopení replikace HCV a účinku SARS. Expresi různých onkogenních markerů lze zkoumat za účelem pochopení jejich chování v reakci na jakoukoli léčbu, jako například ve studii, která použila buňky HuH7 ke zkoumání účinku sloučeniny kaempferolu na vzorec exprese genů dráhy MMP9 a AKT. Tyto dráhy regulují metastazování a invazivitu hepatocelulárního karcinomu. Jiná nedávná studie rovněž zkoumala úlohu genu signální kaskády Wnt/β-katenin v přežívání a růstu buněk HCC.

3. Vývoj léků: Buňky HuH7 jsou široce využívány při screeningu a vývoji léčiv proti rakovině jater. Bylo provedeno mnoho studií, které zkoumaly inhibiční potenciál mnoha rostlinných extraktů, sloučenin na rostlinné bázi, nanočástic a dalších terapeutických látek proti HCC. Studie provedená v roce 2022 studovala proapoptotické a protinádorové vlastnosti radionuklidu proti hepatocelulárnímu karcinomu s použitím buněčné linie HuH7.

4. Buňky HuH7: Buňky HuH7 se staly základnímkamenem při studiu virových infekcí a infekčních onemocnění, zejména viru hepatitidy C (HCV) a jejich interakcí s koronaviry, jako je SARS-CoV-2, který je zodpovědný za koronavirové onemocnění 2019 (COVID-19). Vývoj experimentálních systémů buněčných kultur HCV (HCVcc) využívajících buňky HuH7 významně posunul naši schopnost studovat složitý proces replikace HCV a hostitelské faktory nezbytné pro infekci HCV. To zahrnuje zkoumání účinnosti replikace HCV RNA a produkce infekčních virionů. Odlišné linie buněk HuH7, včetně senescentních a infikovaných variant, poskytují rozmanitý panel pro zkoumání multiplicity infekce, šíření viru a mechanismů inhibice virů, jako je SARS.

Souhrnně lze říci, že studium buněk HuH7 zahrnuje široké spektrum vědeckých výzkumů, od molekulárních mechanismů, které jsou základem virových infekcí, až po podrobné buněčné reakce vyvolané těmito patogeny. Optikou výzkumu HuH7 vědecká komunita nadále odhaluje složitou dynamiku interakcí mezi hostitelem a virem, což přispívá k rozvoji antivirových strategií a k našemu porozumění buněčným determinantám virových onemocnění.

Publikace o HuH-7

Existuje nepřeberné množství publikací využívajících buněčnou linii HuH7 k různým účelům. Zde uvádíme několik nedávných a významných publikací.

• Použití samorozkladných peptidů zaměřených na mitochondrie jako nové léčby buněk hepatocelulárního karcinomu rezistentních na sorafenib.

Tato studie byla publikována v časopise Nature Scientific Reports v roce 2021. Studie použila experimentálně indukované buňky hepatocelulárního karcinomu rezistentní vůči sorafenibu (buněčná linie HuH7) ke zkoumání proapoptotických a protinádorových účinků nedávno vyvinutých peptidů Mito-FF (mitochondrie akumulující peptidy pro samoskladbu).

• Kaempferol inhibuje buněčnou migraci buněk lidského hepatocelulárního karcinomu potlačením signalizace MMP-9 a Akt

Tento článek publikovali Po-Chung Ju a jeho kolegové v časopise Environmental Toxicology v roce 2021. V této studii vědci zkoumali antimetastatický potenciál sloučeniny rostlinného původu, kaempferolu, proti buňkám hepatocelulárního karcinomu (HuH7). Kromě toho také studovali signální dráhy regulující metastazování a invazi buněk rakoviny jater.

• Dafnetin inhibuje přežívání buněk hepatocelulárního karcinomu prostřednictvím regulace signální dráhy Wnt/β-katenin

Tato práce byla publikována v časopise Drug Development Research v roce 2022. Tato studie vysvětluje protinádorovou úlohu sloučeniny dafnetinu proti HCC. Tato sloučenina rostlinného původu inhibuje signalizaci Wnt/β-katenin a omezuje tak růst nádorových buněk.

• RGFP966 potlačuje růst a migraci nádorů prostřednictvím inhibice exprese EGFR v buňkách hepatocelulárního karcinomu in vitro

Tato výzkumná práce publikovaná v časopise Drug Design, Development, and Therapy popisuje roli signalizace EGFR při růstu a metastazování hepatocelulárního karcinomu. Studie využila buňky HuH7 ke zkoumání inhibičního účinku RGFP966, inhibitoru histonové deacetylázy 3 (HDAC3), proti HCC prostřednictvím potlačení genů dráhy EGFR.

• Perrhenát rhenia (188ReO4) vyvolal apoptózu a snížil rakovinný fenotyp u buněk rakoviny jater

Tato publikace v časopise Cells uvádí použití buněk HuH7 při zkoumání anti-HCC potenciálu radionuklidu, tj. perrhenanu rhenia.

• Antivirová aktivita chitosanových nanočástic zapouzdřených kurkuminem proti viru hepatitidy C genotypu 4a v lidských hepatomových buněčných liniích

Tato studie byla publikována v časopise International Journal of Nanomedicine. Studie použila buňky HuH7 ke zkoumání antivirové aktivity chitosanových nanočástic obsahujících kurkumin proti HCV genotypu 4a.

Zdroje HuH-7: Protokoly, videa a další zdroje

Pro kultivaci a udržování buněčné linie HuH7 je k dispozici mnoho zdrojů. Zde se dozvíte o dostupných zdrojích pro vysvětlení protokolů kultivace a transfekce buněk HuH7 a výukových videí.

Protokoly kultivace buněk

Následující zdroje vám mohou pomoci začít s kultivací a údržbou HuH7.

• Informace a zdroje o buněčné kultuře HuH-7 : Natéto webové stránce najdete mnoho užitečných informací, včetně protokolu subkultivace buněčné linie HuH7, jejího skladování a manipulace s ní.

• Protokol kultivace buněk HuH7

Protokoly transfekce HuH7

Buňky HuH7 se transfekují mnoha způsoby. Následující zdroje poskytují velké množství informací o transfekčních protokolech, potřebných činidlech a chemikáliích, užitečných tipech a bezpečnostních opatřeních.

Videa týkající se buněčné linie HuH7

K dispozici je mnoho výukových videí o základních subkultivačních, platačních a transfekčních protokolech a dalších.

• Pasážování buněk: Toto video se zabývázákladním protokolem kultivace buněčné linie.

Očekáváme, že informace uvedené v tomto článku vám pomohou získat základní i pokročilé znalosti o buněčné linii HuH7 před prací s ní. Pokud chcete tyto buňky použít ve své výzkumné práci, můžete si je u nás objednat.

Časté dotazy k buněčné linii HuH7 a virovému výzkumu