Buňky HuH7: Brána k výzkumu hepatomu a viru HCV

Buněčná linie HuH7, odvozená z lidského hepatomu, představuje imortalizovanou sbírku tumorigenních epiteliálních buněk. Tato linie, spolu se svými deriváty HuH7.5 a HuH7.5.1, slouží jako praktický náhradní model primárních hepatocytů v experimentálních kontextech. Používá se převážně v modelech buněčných kultur k výzkumu infekce virem hepatitidy C (HCV) a patofyziologie hepatomu.

Původ a vlastnosti buněk HuH7

Před použitím buněčné linie HuH7 ve výzkumu je nezbytné porozumět jejímu původu, klíčovým vlastnostem a optimálním kultivačním podmínkám.

Buněčná linie HuH7 byla založena Sato, J. a Nakabayshi, H. v roce 1982 a pochází z vysoce diferencované linie hepatocytárního karcinomu. Původně byla získána z hepatocelulárního karcinomu u 57letého japonského muže. Buňky HuH7, které se vyznačují schopností produkovat různé fyziologicky relevantní látky, jako je albumin a alfa-fetoprotein, vykazují vysokou náchylnost k infekci HCV, což je činí vhodnými pro použití v replikonových systémech HCV. Díky této vlastnosti je tato buněčná linie cenná pro screening a vývoj léčiv proti HCV. Buňky HuH7 vykazují epiteliální morfologii s hexagonálním tvarem a během růstu ulpívají na površích a tvoří 2D monovrstvy. V průměru mají buňky HuH7 průměr 21,9 µm a mají tendenci k většímu, zploštělému vzhledu. Buněčná linie HuH7 se vyznačuje heterogenním počtem chromozomů, který se obvykle pohybuje mezi 55 a 63, což odráží genetickou variabilitu v rámci buněčné populace. Tato heterogenita je důsledkem selektivních tlaků, kterým jsou buňky vystaveny během kultivace, a může se lišit v závislosti na laboratorních podmínkách.

Srovnávací analýza: buněčné linie HuH7 vs. HuH7.5

Buněčná linie HuH7.5, derivát linie HuH7, se liší především díky missense mutaci v genu RIG-I (DDX58), který je klíčový pro intracelulární antivirovou odpověď. Tato mutace zvyšuje vnímavost buněk HuH7.5 k replikaci genomové a subgenomové HCV RNA, čímž se liší od mateřské buněčné linie HuH7 z hlediska jejího využití ve virologickém výzkumu.

Kultivace buněk HuH7: Základní postupy pro optimální růst

Buňky HuH7, které jsou nedílnou součástí nesčetných výzkumných studií, vyžadují pro svůj růst přesné kultivační podmínky. Tato část se zabývá základními aspekty kultivace buněk HuH7 a zajišťuje zachování jejich fyziologické relevance ve vědeckých výzkumech.

Dynamika doby zdvojnásobení

Doba zdvojnásobení buněk HuH7 je obvykle 24 hodin, i když rozdíly v kultivačních médiích mohou tuto dobu prodloužit na 36–48 hodin, což podtrhuje vliv podmínek prostředí na buněčnou proliferaci.

Adhezní vlastnosti

Buňky HuH7 tvoří převážně dvourozměrnou monovrstvu, která ulpívá na povrchu kultivačních destiček a lahví, což podtrhuje jejich preferenci stabilního fyzického substrátu před suspenzními kulturami.

Optimální hustota výsevu

Udržení konfluence buněk HuH7 v rozmezí 30–90 % je zásadní pro zabránění poklesu rychlosti proliferace při konfluenci přesahující 90 %. Subkultivace s použitím accutase usnadňuje odloučení buněk a umožňuje výsev v hustotách přizpůsobených experimentálním potřebám, v rozmezí od optimální (2×10⁴ buněk/cm²) až po saturační (6×10⁴ buněk/cm²) úroveň.

Nutriční požadavky

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) s vysokým obsahem glukózy a doplněné 10 % fetálního bovinního séra (FBS) poskytuje ideální nutriční prostředí pro buňky HuH7. Pravidelná obměna média, ideálně 2–3krát týdně, je zásadní pro udržení zdraví buněk.

Podmínky prostředí

Zvlhčený inkubátor nastavený na 5 % CO₂ a 37 °C optimálně podporuje kultivaci buněk HuH7 a simuluje fyziologické podmínky příznivé pro buněčné aktivity.

Dlouhodobé skladování

Pro dlouhodobé uchování by měly být buňky HuH7 skladovány ve fázi par kapalného dusíku, což zajistí jejich životaschopnost pro budoucí výzkum.

Kryokonzervace a obnovení

Pro zachování životaschopnosti buněk během kryokonzervace je zásadní použití techniky postupného zmrazování. Buňky by měly být suspendovány ve speciálně navrženém zmrazovacím médiu, jako je CM-1, které zajistí plynulý přechod ke kryogennímu skladování. Po rozmrazení je pro obnovení buněčných kultur nezbytné rychlé, ale šetrné oživení ve vodní lázni o teplotě 37 °C, následované odstředěním za účelem odstranění mrazicího média a resuspenzí v čerstvém růstovém médiu.

Úvahy o biologické bezpečnosti

Pro manipulaci a množení buněčné linie HuH7 se doporučuje dodržovat protokol biologické bezpečnosti úrovně 1, který je v souladu s bezpečnostními a etickými standardy v laboratorním prostředí.

Dodržováním těchto pečlivě stanovených podmínek kultivace mohou výzkumníci zajistit robustní růst a fyziologickou relevanci buněk HuH7 ve svých vědeckých výzkumech, čímž připravují půdu pro průlomové objevy ve výzkumu hepatomu a viru hepatitidy C.

Využijte buňky HuH7 pro své vědecké objevy

Buňky HuH7: Výhody a nevýhody

Buněčná linie HuH7 má zároveň jak výhody, tak i omezení. Pojďme si projít potenciální klady a zápory této buněčné linie, protože vám to může pomoci rozhodnout, zda je vhodná pro vaše experimenty.

Výhody buněčné linie HuH7

Buňky HuH7 mají mnoho charakteristických vlastností, díky kterým jsou atraktivní pro výzkumné účely.

• Snadné množení: Na rozdíl od jiných lidských hepatomových buněčných linií lze buněčnou linii HuH7 snadno pěstovat bez přidání séra; CLS však doporučuje používat RPMI 1640 s 10 % FBS a 2 mM L-glutaminem. Buňky HuH-7 vylučují růstový faktor, který pomáhá buňkám růst bez séra.
• Flexibilita transfekce: Buněčná linie HuH7 je široce používána pro účely transfekce díky své vysoké vnímavosti k genomu HCV. Proto jsou tyto buňky klíčové pro screening a vývoj léků proti HCV.
• Alternativa k lidským hepatocytům: Buněčná linie HuH7 je vynikající náhradou za lidské hepatocyty. Může pomoci výzkumníkům studovat jaterní transportéry léčiv a porozumět interakci určitých léčiv s MRP (proteiny asociované s multirezistencí).
• Vývoj myšího modelu xenotransplantátu: Buňky HuH7 byly použity k vytvoření myšího modelu xenotransplantátu pocházejícího z buněčné linie. Tento zvířecí model může výzkumníkům poskytnout cenné poznatky o inhibitorech protein kinázy a protinádorových terapiích.
• Výzkum rakoviny: Buněčná linie HuH7 je buněčná linie lidské rakoviny jater, která pomáhá výzkumníkům provádět studie rakoviny jater.

Omezení buněčné linie HuH-7

S kultivací buněčné linie HuH7 jsou spojena určitá omezení.

Mikrobiální kontaminace: Bakteriální kontaminace je nejčastějším problémem v buněčné kultuře. Pokud dojde k infekci, lze ji rozpoznat podle změny pH a zákalu kultivačního média. Mezi bakteriálními kontaminacemi není kontaminace mykoplazmou obvykle zřejmá. Pomalu však ovlivňuje morfologii, genovou expresi a další vlastnosti buněčné linie.

Doba kultivace: Ačkoli je buněčná linie HuH7 nesmrtelná, překročení doby kultivace může postupně ovlivnit zdraví buněk. Může to ovlivnit rychlost proliferace a genovou expresi, což může snížit reprodukovatelnost výsledků. U buněčné linie HuH7 by počet pasáží měl být udržován pod 20–25.

Aplikace buněk HuH-7

Tato buněčná linie odvozená z lidského hepatomu nabízí mnoho možností využití ve výzkumu. Zde popisujeme několik oblastí výzkumu, ve kterých se buněčná linie HuH7 používá.

1. Léková rezistence: HuH7 je buněčná linie hepatocelulárního karcinomu (HCC), kterou lze použít ke studiu lékové rezistence vůči potenciálním léčbám rakoviny jater. Studie provedená v roce 2021 využila buňky HuH7, které byly experimentálně učiněny rezistentními vůči sorafenibu, k vývoji nových a účinných terapeutik, tj. samouspořádávajících se peptidů akumulujících se v mitochondriích.

2. Genetické poznatky a molekulární profilování pomocí buněk HuH7: Jednotlivé buněčné linie HuH7, včetně různých derivátů a variant, umožnily hlubší pochopení genové exprese a role specifických genomických markerů při onemocnění. Techniky, jako je Ramanova spektroskopie, prosazované výzkumníky jako Evgeny Gladilin, byly aplikovány na buňky HuH7 pro molekulární a buněčné profilování, což odhalilo poznatky o buněčné reakci na virovou infekci. Potenciál Ramanovy spektroskopie v kombinaci s metodami, jako je kvantitativní proteomika, usnadnil zkoumání reakcí hostitelských buněk, včetně interferonové reakce a změn v lipidových kapénkách, které jsou zásadní pro pochopení replikace HCV a účinku SARS. Expresi různých onkogenních markerů lze zkoumat za účelem pochopení jejich chování v reakci na jakoukoli léčbu, jako například ve studii, která použila buňky HuH7 ke zkoumání účinku sloučeniny kaempferolu na expresní vzorec genů MMP9 a AKT. Tyto signální dráhy regulují metastázy a invazivitu hepatocelulárního karcinomu. Další nedávná studie také zkoumala roli genu signální kaskády Wnt/β-katenin v přežití a růstu buněk HCC.

3. Vývoj léčiv: Buňky HuH7 se široce používají ve studiích zaměřených na screening a vývoj léčiv proti rakovině jater. Bylo provedeno několik studií s cílem prozkoumat inhibiční potenciál mnoha rostlinných extraktů, rostlinných sloučenin, nanočástic a dalších terapeutických látek proti HCC. Studie provedená v roce 2022 zkoumala proapoptotické a protinádorové vlastnosti radionuklidu proti hepatocelulárnímu karcinomu s využitím buněčné linie HuH7.

4. Buňky HuH7: Středobod virového výzkumu a buněčné analýzy Buňky HuH7 se staly základním kamenem ve studiu virových infekcí a infekčních onemocnění, zejména viru hepatitidy C (HCV) a jejich interakcí s koronaviry, jako je SARS-CoV-2, zodpovědným za onemocnění COVID-19. Vývoj experimentálních systémů buněčných kultur HCV (HCVcc) s využitím buněk HuH7 významně posunul naše schopnosti studovat složitý proces replikace HCV a hostitelské faktory nezbytné pro infekci HCV. To zahrnuje zkoumání účinnosti replikace RNA HCV a produkce infekčních virionů. Různé linie buněk HuH7, včetně senescentních a infikovaných variant, poskytují rozmanitý panel pro zkoumání multiplicity infekce, šíření viru a mechanismů inhibice proti virům, jako je SARS.

Stručně řečeno, studium buněk HuH7 zahrnuje široké spektrum vědeckých otázek, od molekulárních mechanismů, na nichž jsou založeny virové infekce, až po podrobné buněčné reakce vyvolané těmito patogeny. Prostřednictvím výzkumu buněk HuH7 vědecká komunita pokračuje v odhalování komplexní dynamiky interakcí mezi hostitelem a virem, čímž přispívá k pokroku v antivirových strategiích a k našemu porozumění buněčným determinantům virových onemocnění.

Publikace o HuH-7

Existuje velké množství publikací, které využívají buněčnou linii HuH7 k různým účelům. Zde uvádíme několik nedávných a významných publikací.

• Aplikace samouspořádávajících se peptidů zaměřených na mitochondrie jako nová léčba buněk hepatocelulárního karcinomu rezistentních na sorafenib.

Tato studie byla publikována v časopise Nature Scientific Reports v roce 2021. Studie použila experimentálně indukované buňky hepatocelulárního karcinomu rezistentní na sorafenib (buněčná linie HuH7) k vyšetření proapoptotických a protinádorových účinků nedávno vyvinutých Mito-FF (peptidů samosestavujících se a akumulujících se v mitochondriích).

• Kaempferol inhibuje migraci buněk lidského hepatocelulárního karcinomu potlačením MMP-9 a Akt signalizace

Tento článek byl publikován v časopise Environmental Toxicology autory Po-Chung Ju a kolegy v roce 2021. V této studii vědci zkoumali antimetastatický potenciál rostlinné sloučeniny kaempferolu proti buňkám hepatocelulárního karcinomu (HuH7). Kromě toho také studovali signální dráhy regulující metastázy a invazi buněk rakoviny jater.

• Daphnetin inhibuje přežití buněk hepatocelulárního karcinomu prostřednictvím regulace signální dráhy Wnt/β-katenin

Tento článek byl publikován v časopise Drug Development Research v roce 2022. Tato studie vysvětluje protinádorovou roli sloučeniny daphnetinu proti HCC. Tato rostlinná sloučenina inhibuje signální dráhu Wnt/β-katenin, čímž omezuje růst rakovinných buněk.

• RGFP966 potlačuje růst a migraci nádoru prostřednictvím inhibice exprese EGFR v buňkách hepatocelulárního karcinomu in vitro

Tento výzkumný článek, publikovaný v časopise Drug Design, Development, and Therapy, popisuje roli signální dráhy EGFR v růstu a metastázování hepatocelulárního karcinomu. Studie využila buňky HuH7 k prozkoumání inhibičního účinku RGFP966, inhibitoru histon deacetylázy 3 (HDAC3), proti HCC prostřednictvím potlačení genů signální dráhy EGFR.

• Perrhenát rhenia (188ReO4) indukoval apoptózu a snížil nádorový fenotyp v buňkách rakoviny jater

Tato publikace v časopise Cells poukazuje na použití buněk HuH7 při zkoumání potenciálu radionuklidu, tj. perrhenátu rhenia, proti HCC.

• Antivirová aktivita nanočástic chitosanu obsahujících kurkumin proti viru hepatitidy C genotypu 4a v lidských hepatomových buněčných liniích

Tato studie byla publikována v časopise International Journal of Nanomedicine. Studie použila buňky HuH7 k prozkoumání antivirové aktivity nanočástic chitosanu obsahujících kurkumin proti genotypu 4a viru HCV.

Zdroje pro HuH-7: protokoly, videa a další

K dispozici je mnoho zdrojů pro kultivaci a údržbu buněčné linie HuH7. Zde se dozvíte o zdrojích, které vysvětlují protokoly pro kultivaci buněk a transfekci pro HuH7, a o vzdělávacích videích.

Protokoly pro kultivaci buněk

Následující zdroje vám mohou pomoci s kultivací a udržováním buněk HuH7.

• Informace a zdroje o buněčné kultuře HuH-7: Tato webová stránka obsahuje mnoho užitečných informací, včetně protokolu subkultivace buněčné linie HuH7, jejího skladování a manipulace s ní.

• Protokol pro kultivaci buněk HuH7

Protokoly transfekce buněk HuH7

Buňky HuH7 se transfekují mnoha způsoby. Následující zdroje poskytují velké množství informací týkajících se protokolů transfekce, potřebných reagencií a chemikálií, užitečných tipů a bezpečnostních opatření.

Videa týkající se buněčné linie HuH7

K dispozici je mnoho vzdělávacích videí o základních protokolech subkultivace, nanášení na destičky, transfekci a dalších tématech.

• Pasážování buněk: Základy buněčné kultury: Toto video se zabývá základním protokolem kultivace této buněčné linie.

Očekáváme, že informace uvedené v tomto článku vám pomohou získat základní i pokročilé znalosti o buněčné linii HuH7 předtím, než s ní začnete pracovat. Pokud chcete tyto buňky použít ve svém výzkumu, můžete si je u nás objednat.

Často kladené otázky týkající se buněčné linie HuH7 a virologického výzkumu