Buňky HaCaT - zkoumání biologie kůže a nemocí

2.genetické vlastnosti a původ buněk HaCaT

Buňky HaCaT jsou spontánně imortalizovaná linie lidských keratinocytů, která pochází z kůže dospělých a představuje jedinečnou evoluční cestu. Tyto buňky mají mutace v obou alelách genu p53, což je typické pro mutace vyvolané UV zářením [3,4]. Navíc se předpokládá, že buňky HaCaT vznikly mutací tumor supresorového genu p53, po níž následovala ztráta genů senescence [5].

Nádorový supresorový gen p53, známý svou úlohou při opravách DNA a jako strážce genomu, vyvolává odpověď lidské kůže na poškození DNA [4]. Bylo zjištěno, že buňky HaCaT částečně ztratily svůj ochranný mechanismus proti poškození DNA v důsledku mutace genu p53 in vivo, což je činí náchylnými ke kumulaci cytogenetických změn v reakci na zvýšenou kultivační teplotu. Další mechanismus imortalizace buněk HaCaT zahrnuje zvýšenou aktivitu enzymu telomerázy [7]. V normálních buňkách se telomery s každým buněčným dělením průběžně zkracují, dokud není dosaženo buněčné senescence. Telomeráza je specializovaný buněčný enzymový komplex s aktivitou reverzní transkriptázy, který udržuje stabilní délku telomer. Naproti tomu buňky HaCaT vykazují výrazně zvýšenou aktivitu telomerázy, což vede k dobře udržované délce telomer. Tato pozorování potvrzují úlohu telomerázy v procesu imortalizace buněk HaCaT.

Byly identifikovány tři specifické chromozomální translokace, které vedou ke ztrátě jedné kopie ramen chromozomů 3p, 4p a 9p, zisku 9q a vzniku izochromozomů. Ztráta krátkého raménka chromozomu 3p může vést ke ztrátě genů senescence a imortalizaci buněk HaCaT [8]. Buňky HaCaT jsou hypodiploidní a mají odlišné a stabilní markerové chromozomy představující jejich monoklonální původ. Vlastnosti a hlava buněčné linie HaCaT byly potvrzeny pomocí DNA fingerprintingu s hypervariabilními minisatelitními markery [3-6].

3.jak sklízet buňky HaCaT v 5 jednoduchých krocích

4. Odstraňte kultivační médium a opláchněte adherované buňky pomocí 3-5 ml PBS bez vápníku a hořčíku pro baňky T25 nebo 5-10 ml pro baňky T75.
5. Přidejte 1-2 ml čerstvě připraveného 0,05% roztoku EDTA na baňku T25 nebo 2,5 ml na baňku T75, aby byl pokryt celý buněčný list, a inkubujte při 37 °C po dobu 10 minut.
6. Přidejte 1 ml čerstvě připraveného roztoku trypsinu/EDTA (0,05 %/0,025 %) na baňku T25 nebo 2,5 ml na baňku T75 a opět zajistěte úplné pokrytí buněčného listu. Buňky by se měly oddělit během 1-2 minut.
7. Zastavte trypsinovou aktivitu přidáním buněčného kultivačního média obsahujícího FBS.
8. Dávkujte buňky do nových baněk obsahujících čerstvé médium pro kultivaci buněk.

4. Použití buněk HaCaT

Buňky HaCaT jsou cenným nástrojem pro studium keratinocytů [9]. Tyto nesmrtelné buňky fungují jako preneoplastické buňky a mohou poskytnout vhled do změn, které se podílejí na maligní a neoplastické transformaci [10]. Jednovrstvé buněčné kultury HaCaT jsou nezbytné pro aplikace analýzy buněčné toxicity a hojení ran in vitro. Buňky HaCaT lze také použít k hodnocení toxicity kůže způsobené různými látkami a neoplastickými nebo zánětlivými procesy. Lze je využít k analýze různých mechanismů kožních alergických reakcí, účinků reaktivních forem kyslíku a ozáření UV zářením. Po stimulaci se buňky HaCaT mohou diferencovat a exprimovat specifické diferenciační markery, jako jsou involucrin, K14 a K10. Buňky HaCaT se také běžně používají jako model pro studium patofyziologie epidermální homeostázy [6].

Buňky HaCaT si po transplantaci zachovávají schopnost rekonstituovat strukturovanou epidermis in vivo, což vede k vytvoření stratifikované epidermální struktury, kterou lze měnit mezi bazálním a diferencovaným stavem pomocí změn koncentrace vápníku v médiu. Tyto buňky rovněž umožňují charakterizovat několik biologických procesů, například jejich využití jako modelového systému pro vitamin D a metabolismus v kůži. Vzhledem k tomu, že buňky HaCaT nejsou geneticky modifikované, představují objektivní pohled na široké spektrum počátečních genetických dějů v lidské kůži.

5. Doporučená videa: Videa: Objevování světa buněk HaCaT

"Migrace buněk HaCaT": Toto video ukazuje proces migrace buněk HaCaT. Migrace buněk je zásadním procesem pro různé biologické procesy, jako je hojení ran a metastazování rakoviny. Video demonstruje pohyb buněk HaCaT pod mikroskopem a poskytuje vizuální představu o tom, jak tyto buňky migrují. Aktivita buněk je pozorována při jejich pohybu z jednoho místa na druhé a video poskytuje jasnou ilustraci změn, ke kterým v buňkách během tohoto procesu dochází.

"Scratch Assay carried out on HaCaT cells": Toto video ukazuje Scratch Assay prováděný na buňkách HaCaT. Scratch Assay je široce používaná technika ke studiu migrace buněk a v tomto případě se používá k analýze migrace buněk HaCaT. Video ukazuje proces vytvoření škrábance na povrchu misky s buněčnou kulturou, který je poté pozorován pod mikroskopem, jak buňky HaCaT migrují a v průběhu času mezeru uzavírají.

"Buněčný růst keratinocytů HaCaT pro experimenty s hojením ran": Toto video ukazuje proces růstu buněk keratinocytů HaCaT pro experimenty s hojením ran. Keratinocyty HaCaT jsou běžně používanou buněčnou linií ve studiích hojení ran.

"Diferenciace buněk HaCaT": Toto video ukazuje kroky nezbytné k diferenciaci buněk HaCaT. Buňky HaCaT se mohou diferencovat na různé typy kožních buněk. Video ukazuje změny buněk HaCaT při jejich diferenciaci a vizuálně znázorňuje různé markery a charakteristiky diferenciace. Proces diferenciace má zásadní význam pro normální fungování kůže a video poukazuje na různé fáze diferenciace, kterými buňky HaCaT procházejí.

Odkazy

1. Angel P a Karin M: Úloha Jun, Fos a komplexu AP-1 v buněčné proliferaci a transformaci. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analysing qualitative data (Analýza kvalitativních údajů). The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide (Aplikovaný výzkumný design: praktický průvodce). Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol. 1988;106:761-771.