Клетъчна култура на бозайници: Основи и техники
Клетъчните култури от бозайници са основополагаща техника в биологичните изследвания, която позволява на учените да изследват клетки в контролирана среда извън живите организми. Този процес включва изолиране на клетки от тъкани, поддържането им при внимателно контролирани условия и размножаването им за различни експериментални цели. Клетъчните култури от бозайници са от решаващо значение за разбирането на клетъчните процеси, механизмите на заболяванията и разработването на нови терапии, включително такива, при които се използват безсмъртни клетъчни линии
Основни изводи:
- Клетките могат да бъдат изолирани от тъкани чрез ензимно разграждане или експлантационни методи за култивиране
- Първичните клетки имат ограничена продължителност на живота, докато безсмъртните клетъчни линии могат да се размножават неограничено дълго време
- Условията на култивиране, включително съставът на хранителната среда, са от решаващо значение за оцеляването и пролиферацията на клетките
- Клетките могат да се отглеждат в суспензия или като адхезивни култури, в зависимост от техния вид и изследователски нужди
- Обичайните среди за култивиране включват MEM, DMEM и RPMI 1640, всяка от които е пригодена за специфични типове клетки
- Типичните условия за растеж включват температура 37°C, 5% CO2 и 95% относителна влажност
- Все по-често се използват алтернативи на серума като човешки тромбоцитен лизат (hPL), за да се избегнат потенциални проблеми със замърсяването
Техники за изолиране на клетки
Процесът на създаване на клетъчна култура започва с изолиране на клетки от тъкани. Съществуват няколко метода за постигане на това, всеки от които е подходящ за различни видове тъкани и изследователски цели. Изолирането на клетки от кръвни проби е сравнително лесно, като белите кръвни клетки са основният фокус за култивиране поради техните възможности за растеж. Твърдите тъкани изискват по-сложни техники за изолиране. Един от разпространените методи включва ензимно разграждане, при което ензими като колагеназа, трипсин или проназа се използват за разграждане на извънклетъчната матрица, като се освобождават отделни клетки в суспензия. Алтернативно изследователите могат да използват метода на експлантната култура, при който малки парчета тъкан се поставят директно в хранителна среда, което позволява на клетките да мигрират и да се размножават. Изборът между тези методи често зависи от специфичния тип тъкан, желаната клетъчна популация и планираната експериментална употреба. Важно е да се отбележи, че клетките, изолирани директно от даден организъм, се наричат първични клетки и с някои изключения, като например клетките, получени от тумори, обикновено имат ограничена продължителност на живота в култура, преди да претърпят стареене
Основни продукти за клетъчни култури от бозайници
| Име на продукта | Номер на продукта | Категория | Приложение |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/L глюкоза, w: 4 mM L-глутамин, w: 1,5 g/L NaHCO3, w: 1,0 mM натриев пируват | 820300a | Среда за култивиране | Обща среда за различни типове клетки на бозайници |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L глюкоза, w: 1,6 mM L-глутамин, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM натриев пируват, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Среда за култивиране | Подходящи за широк спектър от клетки на бозайници, особено за епителни клетки |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM стабилен глутамин, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Среда за култивиране | Обикновено се използват за лимфоидни клетки и хибридни клетъчни линии |
| Accutase | 830100 | Клетъчна дисоциация | Разтвор за деликатно отделяне на клетки за адхезивни клетки |
| Среда за замразяване CM-1 | 800150 | Криоконсервация | За замразяване и дългосрочно съхранение на клетки от бозайници |
| Среда за замразяване CM-ACF, без серум | 800650 | Криоконсервация | Среда за замразяване на клетки без животински компоненти |
| PBS | 860015 | Буферен разтвор | За промиване на клетките и поддържане на pH баланс |
| Среда за растеж на ендотелни клетки | 820731 | Специализирана среда | Оптимизирана за култивиране на ендотелни клетки |
| Изследване на микоплазми | 900159 | Контрол на качеството | От съществено значение за откриване на микоплазмено замърсяване в културите |
| Удостоверяване на клетъчни линии - човешки | 900154 | Контрол на качеството | Проверява идентичността на човешки клетъчни линии |
Настоящата таблица представя селекция от основни продукти за клетъчни култури от бозайници. За пълната ни гама от продукти за клетъчни култури, включително специализирани среди и реактиви, моля, посетете страницата ни с категория " Среди и реактиви ".
- щадяща алтернатива на трипсина
Accutase е разтвор за отделяне на клетки, който прави революция в производството на клетъчни култури. Това е смес от протеолитични и колагенолитични ензими, която имитира действието на трипсин и колагеназа. За разлика от трипсина Accutase не съдържа никакви бозайнически или бактериални компоненти и е много по-щадящ за клетките, което го прави идеално решение за рутинно отделяне на клетки от стандартни пластмасови съдове за тъканни култури и пластмасови съдове с адхезионно покритие. В тази публикация в блога ще разгледаме ползите и приложенията на Accutase и как тя променя правилата на играта в клетъчните култури.
Предимства на Accutase
Accutase има няколко предимства пред традиционните разтвори на трипсин. Първо, тя може да се използва винаги, когато е необходимо нежно и ефикасно отделяне на всяка адхезивна клетъчна линия, което я прави директен заместител на трипсина. Второ, Accutase работи изключително добре с ембрионални и невронни стволови клетки и е доказано, че запазва жизнеспособността на тези клетки след пасиране. Трето, Accutase запазва повечето епитопи за последващ анализ с поточна цитометрия, което я прави идеална за анализ на маркери на клетъчната повърхност.
Освен това Accutase не трябва да се неутрализира при пасиране на адхерентни клетки. Добавянето на повече среда след разделянето на клетките разрежда Accutase, така че тя вече не е в състояние да отдели клетките. Това елиминира нуждата от стъпка за инактивиране и спестява време на техниците, занимаващи се с клетъчни култури. И накрая, не е необходимо Accutase да се аликвотира, а една бутилка е стабилна в хладилника в продължение на 2 месеца.
Приложения на Accutase
Accutase е директен заместител на разтвора на трипсин и може да се използва за пасиране на клетъчни линии. Освен това Accutase се представя добре при отделяне на клетки за анализ на много маркери на клетъчната повърхност с помощта на поточна цитометрия и за сортиране на клетки. Други приложения надолу по веригата на обработка с Accutase включват анализ на маркери на клетъчната повърхност, анализ на растежа на вируси, клетъчна пролиферация, анализи на миграцията на туморни клетки, рутинно пасиране на клетки, увеличаване на производството (биореактор) и поточна цитометрия.
Състав на Accutase
Accutase не съдържа компоненти от бозайници или бактерии и представлява естествена ензимна смес с протеолитична и колагенолитична ензимна активност. Тя е формулирана в много по-ниска концентрация от трипсина и колагеназата, което я прави по-малко токсична и по-нежна, но също толкова ефективна.
Ефективност на Accutase
Доказано е, че Accutase е ефективна при отделянето на първични и стволови клетки и поддържането на висока клетъчна жизнеспособност в сравнение с ензими от животински произход, като трипсин. 100 % от клетките се възстановяват след 10 минути и няма вреда от оставянето на клетките в Accutase до 45 минути, благодарение на авторазграждането на Accutase.
В обобщение
В заключение, Accutase е мощно решение, което променя правилата на играта в клетъчните култури. Със своята щадяща природа, ефективност и гъвкавост Accutase е идеалната алтернатива на трипсина. Ако търсите надеждно и ефикасно решение за отделяне на клетки, Accutase е решението за вас.
Фосфатно-буферираният физиологичен разтвор (PBS) е широко използван буферен разтвор в биологичните и химичните изследвания. Той играе решаваща роля за поддържане на pH баланса и осмоларността по време на различни експериментални процедури, включително обработка на тъкани и клетъчни култури. Нашият разтвор на PBS е щателно формулиран с висококачествени съставки, за да се гарантира стабилност и надеждност при всеки експеримент. Осмоларността и концентрацията на йони в нашия разтвор PBS са близки до тези в човешкото тяло, което го прави изотоничен и нетоксичен за повечето клетки.
Състав на нашия разтвор на PBS
Нашият разтвор на PBS е смес от свръхчисти фосфатни буфери и физиологични разтвори с коригирано pH. В работна концентрация 1Х той съдържа:
8000 mg/L Натриев хлорид (NaCl)
200 mg/L Калиев хлорид (KCl)
1150 mg/L Натриев фосфат двуосновен безводен (Na2HPO4)
200 mg/L Калиев фосфат монобазичен безводен (KH2PO4)
Този състав осигурява оптимално рН и йонно равновесие, подходящи за широк спектър от биологични приложения.
Приложения на нашия разтвор на PBS
Нашият разтвор на PBS е идеален за различни приложения в биологичните изследвания. Неговите изотонични и нетоксични свойства го правят подходящ за разреждане на вещества и за изплакване на клетъчни контейнери. Разтворите PBS, съдържащи EDTA, са ефективни за отделяне на прикрепени и слепени клетки. Въпреки това към PBS не трябва да се добавят двувалентни метали, като например цинк, тъй като това може да доведе до утаяване. В такива случаи се препоръчват буферите на Good's. Освен това нашият разтвор на PBS е приемлива алтернатива на вирусната транспортна среда за транспортиране и съхранение на РНК вируси, включително SARS-CoV-2.
Контрол на качеството
Стерилно филтриран
Съхранение и срок на годност
Съхранявайте при температура от +2°C до +25°C, защитени от светлина.
След отваряне съхранявайте при 2°C до 25°C и използвайте в рамките на 24 месеца.
Условия за транспортиране
Температура на околната среда
Поддръжка
Съхранявайте в хладилник при температура от +2°C до +8°C на тъмно. Избягвайте замразяването и честото затопляне до +37°C, тъй като това намалява качеството на продукта.
Не нагрявайте средата над 37°C и не използвайте неконтролирани източници на топлина, като например микровълнови уреди.
Ако трябва да се използва само част от средата, отстранете необходимото количество и го загрейте до стайна температура преди употреба.
Състав
Категория
Компоненти
Концентрация (mg/L)
Соли
Калиев хлорид
200
Калиев фосфат монобазичен безводен
200
Натриев хлорид
8000
Натриев фосфат двуосновен безводен
1150
Метод за анализ
CLS предлага както краткосрочни, така и дългосрочни тестове за откриване на микоплазма. В първия случай пробите се изследват веднага след пристигането им, докато във втория случай се започва отглеждането на клетъчна култура и клетките се изследват след 14 дни култивиране без антибиотици. Изследването за микоплазма се извършва чрез двуточкова система за откриване, като се използват както PlasmoTest™
- комплект за откриване на микоплазма (Invivogen), така и Certus QC
- комплект за откриване на mycoADVANCED (Certus).
Проби
За бързия тест, моля, осигурете минимум 50 µl клетъчна суспензия, съдържаща 50 000 клетки. Клетъчната суспензия може да се достави при стайна температура.
За първокласния тест, моля, осигурете минимум 1 милион клетки в подходяща замразяваща среда, за да се осигури стабилна и здрава култура за култивиране и последващо тестване на клетките. Моля, изпратете пробите върху сух лед.
Моля, попълнете формуляра за проба за изследване на микоплазма и го включете към пратката с пробите.
Колориметричен репортерски анализ
Този тест е колориметричен тест на клетъчна основа. В присъствието на микоплазма клетъчна линия репортер индуцира сигнална каскада, която предизвиква промяна на цвета на средата от червено в синьо. Тестът се извършва в 96-ямкови многоядкови плаки. Сигналите се откриват в спектрофотометър за микроплатки при 620-655 nm. Откриват се всички видове микоплазма и ахолеплазма, но също и други замърсители в клетъчната култура, като например бактерии.
Изотермично усилване
Изотермичната амплификация е бърз и надежден тест, основан на изотермична амплификация на специфична за микоплазмата ДНК, съчетана с детекция в реално време с помощта на ДНК-интеркалиращо багрило. Тестът е в състояние да открие шест от най-често срещаните видове, които съставляват > 95 % от замърсяванията: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis и A.laidlawii. Поради хомоложността на последователността ще бъдат открити и други видове микоплазми (M.pneumoniae, M.gallisepticum и M.synoviae). За да се определи дали пробата е положителна или отрицателна за микоплазма, се изследва температурата на топене (Tm).
Заключение: Ключовата роля на клетъчните култури на бозайници в съвременните изследвания
Клетъчните култури от бозайници направиха революция в биологичните и медицинските изследвания, предоставяйки на учените мощни инструменти за изследване на сложни клетъчни процеси, механизми на заболявания и потенциални терапевтични интервенции. От изолирането на първични клетки до разработването на безсмъртни клетъчни линии, тази техника се е превърнала в незаменима част от съвременния научен инструментариум
Пътят на клетъчните култури от бозайници започва с внимателни техники за изолиране, преминава през щателното поддържане на клетките в специализирани среди и завършва с широк спектър от приложения в различни области на науката. Независимо дали става въпрос за изследване на рака, откриване на лекарства или основна клетъчна биология, възможността за отглеждане и манипулиране на клетки на бозайници in vitro откри безпрецедентни пътища за научни изследвания
Ключът към успеха на клетъчните култури от бозайници са внимателно контролираните условия, при които се поддържат клетките. От състава на хранителните среди до точните параметри на околната среда в инкубаторите - всеки аспект е оптимизиран, за да наподобява възможно най-точно естествените условия на клетките. Това внимание към детайлите гарантира надеждността и възпроизводимостта на експериментите, които са крайъгълен камък на добрата научна практика
Разработването на имортализирани клетъчни линии, като например широко използваните HeLa клетки, допълнително разшири възможностите на клетъчните култури. Тези клетъчни линии осигуряват последователни, лесно достъпни клетъчни модели, които ускориха изследванията в множество дисциплини
С поглед към бъдещето клетъчните култури от бозайници продължават да се развиват. Напредъкът в техниките за 3D култивиране, разработването на органоиди и използването на химически дефинирани среди разширява границите на възможното в клетъчните култури. Тези разработки обещават да доближат моделите in vitro още повече до сложността на системите in vivo, което може да доведе до революция в откриването на лекарства, персонализираната медицина и разбирането ни за човешката биология
В заключение, клетъчните култури от бозайници остават динамична и съществена техника в изследванията в областта на науките за живота. Нейното непрекъснато усъвършенстване и прилагане несъмнено ще играе решаваща роля за решаването на някои от най-належащите въпроси в биологията и медицината, като ще стимулира научния прогрес през следващите години