HaCaT клетки - изследване на биологията на кожата и заболяванията

2.генетични характеристики и произход на клетките HaCaT

Клетките HaCaT са спонтанно имортезирана човешка кератиноцитна клетъчна линия, произхождаща от възрастна кожа и представляваща уникален еволюционен път. Тези клетки притежават мутации в двата алела на гена p53, което е типично за мутациите, предизвикани от UV радиация [3,4]. Освен това се предполага, че HaCaT клетките са се образували чрез мутации на туморния супресорен ген p53, последвани от загуба на гени за стареене [5].

Туморният супресорен ген p53, известен с ролята си в поправката на ДНК и като пазител на генома, предизвиква отговора на човешката кожа към увреждане на ДНК [4]. Наблюдавано е, че HaCaT клетките частично са загубили защитния си механизъм срещу ДНК увреждане поради in vivo мутация на гена p53, което ги прави податливи на натрупване на цитогенетични промени в отговор на повишената температура на култивиране. Друг механизъм за безсмъртие на HaCaT клетките включва повишена активност на ензима теломераза [7]. В нормалните клетки теломерите непрекъснато се скъсяват при всяко клетъчно делене до достигане на клетъчна старост. Теломеразата е специализиран клетъчен ензимен комплекс с обратна транскриптазна активност, който поддържа стабилна дължина на теломерите. За разлика от тях клетките HaCaT показват значително повишена теломеразна активност, което води до добре поддържана дължина на теломерите. Тези наблюдения потвърждават ролята на теломеразата в процеса на безсмъртие на HaCaT клетките.

Идентифицирани са три специфични хромозомни транслокации, които водят до загуба на едно копие на хромозомните рамена 3р, 4р и 9р, до придобиване на 9q и до образуване на изохромозоми. Загубата на късото рамо на хромозома 3р може да доведе до загуба на гени за стареене и до безсмъртие на HaCaT клетките [8]. Клетките HaCaT са хиподиплоидни и притежават отделни и стабилни маркерни хромозоми, представящи техния моноклонален произход. Характеристиките и главата на клетъчната линия HaCaT са потвърдени с помощта на ДНК пръстови отпечатъци с хипервариабилни минисателитни маркери [3-6].

3.как да съберем HaCaT клетките в 5 прости стъпки

4. Отстранете хранителната среда и изплакнете прилепналите клетки, като използвате 3-5 ml PBS без калций и магнезий за колби Т25 или 5-10 ml за колби Т75.
5. Добавете 1-2 ml прясно приготвен 0,05% разтвор на EDTA за колба Т25 или 2,5 ml за колба Т75, като се уверите, че целият клетъчен лист е покрит, и инкубирайте при 37 °C за 10 минути.
6. Добавете 1 ml прясно приготвен разтвор на трипсин/EDTA (0,05%/0,025%) за колба Т25 или 2,5 ml за колба Т75, като отново се уверите, че е покрит целият клетъчен лист. Клетките трябва да се отделят в рамките на 1-2 минути.
7. Спрете активността на трипсина, като добавите среда за клетъчна култура, съдържаща FBS.
8. Разпределете клетките в нови колби, съдържащи прясна среда за клетъчни култури.

4. Приложения на HaCaT клетките

HaCaT клетките са ценен инструмент за изследване на кератиноцити [9]. Тези безсмъртни клетки функционират като пренеопластични клетки и могат да дадат представа за промените, свързани със злокачествената и неопластичната трансформация [10]. Монослойните HaCaT клетъчни култури са от съществено значение за приложенията за анализ на клетъчната токсичност и in vitro заздравяването на рани. HaCaT клетките могат да се използват и за оценка на кожната токсичност, причинена от различни агенти и неопластични или възпалителни процеси. Те могат да се използват за анализ на различни механизми на кожни алергични реакции, ефектите на реактивните кислородни видове и облъчването с UV лъчи. При стимулиране HaCaT клетките могат да се диференцират и да експресират специфични маркери за диференциация, като инволукрин, К14 и К10. HaCaT клетките често се използват и като модел за изследване на патофизиологията на епидермалната хомеостаза [6].

HaCaT клетките запазват способността си да възстановяват структуриран епидермис in vivo след трансплантация, което води до стратифицирана епидермална структура, която може да се променя между базово и диференцирано състояние чрез промени в концентрацията на калций в средата. Тези клетки също така позволяват характеризирането на няколко биологични процеса, като например използването им като моделна система за витамин D и метаболизма в кожата. Тъй като HaCaT клетките не са генетично модифицирани, те представят безпристрастен поглед върху широкия спектър от първоначални генетични събития в човешката кожа.

5. Представени видеоклипове: Изследване на света на HaCaT клетките

"Миграция на HaCaT клетките": Този видеоклип представя процеса на клетъчна миграция в клетките HaCaT. Миграцията на клетките е съществен процес за различни биологични процеси, като заздравяване на рани и метастазиране на рак. Видеоклипът демонстрира движението на HaCaT клетки под микроскоп, като осигурява визуално представяне на начина, по който тези клетки мигрират. Активността на клетките се наблюдава, докато те се придвижват от едно място на друго, и видеото предоставя ясна илюстрация на промените, които настъпват в клетките по време на този процес.

"Изследване на надраскване, проведено върху HaCaT клетки": Този видеоклип показва анализ на надраскване, извършен върху HaCaT клетки. Scratch Assay е широко използвана техника за изследване на клетъчната миграция, а в този случай се използва за анализ на миграцията на HaCaT клетки. Видеото демонстрира процеса на създаване на драскотина върху повърхността на блюдо за клетъчни култури, която след това се наблюдава под микроскоп, докато HaCaT клетките мигрират и затварят пролуката с течение на времето.

"Клетъчен растеж на кератиноцити HaCaT за експерименти за заздравяване на рани": Този видеоклип демонстрира процеса на клетъчен растеж на кератиноцити HaCaT за експерименти за заздравяване на рани. Кератиноцитите HaCaT са често използвана клетъчна линия в изследванията за заздравяване на рани.

"Диференциране на клетките HaCaT": Този видеоклип показва необходимите стъпки за диференциране на клетките HaCaT. Клетките HaCaT могат да се диференцират в различни видове кожни клетки. Видеоклипът демонстрира промените в HaCaT клетките при тяхната диференциация, като визуално представя различните маркери и характеристики на диференциацията. Процесът на диференциация е от решаващо значение за нормалното функциониране на кожата и видеото подчертава различните етапи на диференциация, през които преминават HaCaT клетките.

Препратки

1. Angel P и Karin M: Ролята на Jun, Fos и комплекса AP-1 в клетъчната пролиферация и трансформация. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously emerging long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines (Мутации на p53 в човешки безсмъртни епителни клетъчни линии). Канцерогенеза 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Горещи точки на мутации, дължащи се на слънчева светлина, в гена p53 при немеланомен рак на кожата. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993 г
5. Fusenig NE, Boukamp P. Многобройни етапи и генетични промени в имортализацията, злокачествената трансформация и туморната прогресия на човешки кожни кератиноцити. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes (Активност на теломеразата в регенеративния базален слой на епидермиса при човешката кожа и в безсмъртни и карциномни кожни кератиноцити). Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes (HaCaT клетките като надежден ин витро модел за дисекция на възпалителния/възстановителния отговор на човешките кератиноцити). Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line (Нормална кератинизация при спонтанно имортализирана анеуплоидна човешка кератиноцитна клетъчна линия) J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analysing qualitative data (Анализ на качествени данни). Комплектът за качествени изследвания на Sage. Лондон: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide (Приложен изследователски дизайн: практическо ръководство). Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line (Нормална кератинизация при спонтанно имортализирана анеуплоидна човешка кератиноцитна клетъчна линия) Cell Biol. 1988;106:761-771.