HaCaT клетки – изследване на биологията и заболяванията на кожата

Генетични характеристики и произход на HaCaT клетките

HaCaT клетките са спонтанно иммортализирана клетъчна линия от човешки кератиноцити, произхождаща от кожата на възрастни и представляваща уникален еволюционен път. Тези клетки притежават мутации и в двата алела на гена p53, което е типично за мутации, предизвикани от ултравиолетова радиация [3,4]. Освен това се предполага, че HaCaT клетките са били генерирани от мутации в тумор-супресорния ген p53, последвани от загуба на гени за стареене [5].

Тумор-супресорният ген p53, известен с ролята си в репарацията на ДНК и като пазител на генома, индуцира реакцията на човешката кожа към увреждане на ДНК [4]. Наблюдавано е, че HaCaT клетките са загубили частично защитния си механизъм срещу увреждане на ДНК поради in vivo мутация на гена p53, което ги прави податливи на натрупване на цитогенетични промени в отговор на повишени температури на култивиране. Друг механизъм за безсмъртие на HaCaT клетките включва повишена активност на ензима теломераза [7]. В нормалните клетки теломерите непрекъснато се скъсяват с всяко клетъчно деление, докато не се достигне клетъчно стареене. Теломеразата е специализиран клетъчен ензимен комплекс с обратна транскриптазна активност, който поддържа стабилна дължина на теломерите. За разлика от това, HaCaT клетките показват значително повишена активност на теломеразата, което води до добре поддържана дължина на теломерите. Тези наблюдения потвърждават ролята на теломеразата в процеса на безсмъртие на HaCaT клетките.

Идентифицирани са три специфични хромозомни транслокации, които водят до загуба на една копия от рамената на хромозоми 3p, 4p и 9p, придобиване на 9q и образуване на изохромозоми. Загубата на късия рамо на хромозома 3p може да доведе до загуба на гени на стареене и безсмъртието на HaCaT клетките [8]. HaCaT клетките са хиподиплоидни и притежават отличителни и стабилни маркерни хромозоми, представляващи техния моноклонален произход. Характеристиките и произходът на клетъчната линия HaCaT бяха потвърдени чрез ДНК-отпечатване с хипервариабилни минисателитни маркери [3-6].

Как да съберете HaCaT клетки в 5 лесни стъпки

4. Отстранете културалната среда и изплакнете адхезивните клетки с 3-5 мл PBS без калций и магнезий за T25 колби или 5-10 мл за T75 колби.
5. Добавете 1-2 мл прясно приготвен 0,05% EDTA разтвор на колба T25 или 2,5 мл на колба T75, като се уверите, че целият клетъчен слой е покрит, и инкубирайте при 37°C за 10 минути.
6. Добавете 1 мл прясно приготвен разтвор на трипсин/EDTA (0,05%/0,025%) на колба T25 или 2,5 мл на колба T75, като отново се уверите, че клетъчният слой е изцяло покрит. Клетките трябва да се отлепят в рамките на 1–2 минути.
7. Спрете активността на трипсина, като добавите клетъчна култура, съдържаща FBS.
8. Разпределете клетките в нови колби, съдържащи свежа клетъчна култура.

Приложения на HaCaT клетки

HaCaT клетките са ценен инструмент за изучаване на кератиноцитите [9]. Тези безсмъртни клетки функционират като пренеопластични клетки и могат да предоставят информация за промените, свързани с малигнената и неопластичната трансформация [10]. Монослойните HaCaT клетъчни култури са от съществено значение за приложенията за анализ на клетъчната токсичност и заздравяването на рани in vitro. HaCaT клетките могат да се използват и за оценка на кожната токсичност, причинена от различни агенти, както и на неопластични или възпалителни процеси. Те могат да се използват за анализ на различни механизми на кожни алергични реакции, ефектите на реактивните кислородни видове и облъчването с UV лъчи. При стимулация HaCaT клетките могат да се диференцират и да експресират специфични маркери за диференциация, като инволюкрин, K14 и K10. HaCaT клетките се използват често и като модел за изучаване на патофизиологията на епидермалната хомеостаза [6].

Избрани видеоклипове: Откриване на света на HaCaT-клетките

„Миграция на HaCaT клетки“: Това видео представя процеса на миграция на HaCaT клетките. Миграцията на клетките е съществен процес за различни биологични процеси, като заздравяване на рани и метастазиране на рак. Видеото демонстрира движението на HaCaT клетките под микроскоп, като предоставя визуално представяне на това как тези клетки мигрират. Активността на клетките се наблюдава, докато те се придвижват от едно място на друго, а видеото предоставя ясна илюстрация на промените, които настъпват в клетките по време на този процес.

„Скрач тест, проведен върху HaCaT клетки“: Това видео показва скрач тест, проведен върху HaCaT клетки. Scratch Assay е широко използвана техника за изучаване на клетъчната миграция и в този случай се използва за анализ на миграцията на HaCaT клетки. Видеото демонстрира процеса на създаване на драскотина върху повърхността на съда за клетъчна култура, която след това се наблюдава под микроскоп, докато HaCaT клетките мигрират и затварят празнината с течение на времето.

„Клетъчен растеж на HaCaT кератиноцити за експерименти по заздравяване на рани“: Това видео демонстрира процеса на клетъчен растеж на HaCaT кератиноцити за експерименти по заздравяване на рани. HaCaT кератиноцитите са често използвана клетъчна линия в проучванията за заздравяване на рани.

„Диференциация на HaCaT клетки“: Това видео представя необходимите стъпки за диференциация на HaCaT клетки. HaCaT клетките могат да се диференцират в различни видове кожни клетки. Видеото демонстрира промените в HaCaT клетките по време на диференциацията, като визуално представя различните маркери и характеристики на диференциацията. Процесът на диференциация е от решаващо значение за нормалното функциониране на кожата, а видеото подчертава различните етапи на диференциация, през които преминават HaCaT клетките.

Източници

1. Angel P и Karin M: Ролята на Jun, Fos и AP-1 комплекса в клетъчната пролиферация и трансформация. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Регулирането на хиперпластичния растеж на епидермиса. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Изолиране и характеризиране на спонтанно възникваща дългоживееща линия от човешки кератиноцити (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 мутации в човешки безсмъртни епителни клетъчни линии. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Горещи точки на мутации, дължащи се на слънчева светлина, в гена p53 при немеланомни кожни ракови заболявания. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Множествени етапи и генетични промени при безсмъртието, злокачествената трансформация и туморната прогресия на човешките кожни кератиноцити. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Теломеразна активност в регенеративния базален слой на епидермиса в човешката кожа и в безсмъртни и произхождащи от карцином кожни кератиноцити. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT клетки като надежден in vitro диференциационен модел за анализ на възпалителната/възстановителната реакция на човешките кератиноцити. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. и др. Нормална кератинизация в спонтанно иммортализирана анеуплоидна клетъчна линия от човешки кератиноцити. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
9. Gibbs, Graham: Анализ на качествени данни. Комплект за качествено изследване на Sage. Лондон: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Дизайн на приложни изследвания: практическо ръководство. Sage: Лондон
11. Букамп П., Петрусевска Р. Т., Брайткройц Д., Хорнунг Дж., Маркхам А., Фузениг Н. Е. Нормална кератинизация в спонтанно безсмъртна анеуплоидна клетъчна линия от човешки кератиноцити.  Cell Biol. (1988); 106:761–771.