Публикувано: 2023 г. | Последно актуализирано: май 2026 г.

Пълно ръководство за замразяване на клетки: гарантиране на жизнеспособност и стерилноста

Замразяването на клетки е критичен процес в управлението на клетъчните култури, който гарантира дългосрочно съхранение и запазване на ценни клетъчни линии. Независимо дали се работи с човешки или животински клетки, спазването на точни протоколи и поддържането на строги асептични техники са от първостепенно значение за постигането на успешна криоконсервация.

Това ръководство предоставя подробни инструкции относно необходимите материали, реагенти и стъпка по стъпка процедури за ефективно замразяване на клетки, като се запазва тяхната жизнеспособност и стерилност. Като се придържат към тези насоки, изследователите могат уверено да съхраняват и по-късно да възстановяват клетъчни култури с минимална загуба на клетъчна жизнеспособност, поддържайки целостта и надеждността на своите експериментални резултати.

За начало е от съществено значение да се създаде стерилна работна среда. Правилните асептични техники играят решаваща роля за предотвратяване на замърсяването и осигуряване на стерилността на културите.

Асептична техника

Следвайте асептичните техники през целия процес, за да гарантирате стерилността на културите.

Цялостен процес на замразяване на клетки

Тази диаграма предоставя подробно визуално ръководство за основните стъпки, свързани с правилното замразяване на клетки. Спазвайте тези процедури, за да гарантирате висока жизнеспособност и целостност на клетките по време на процеса на криоконсервация.

Подготовка на среда за замразяване

Подгответе криозащитна среда за замразяване според типа клетки:

Култури в среди, съдържащи FBS: 90% FBS + 10% DMSO или 70% среда за растеж, 20% FBS и 10% DMSO
Клетки, изискващи глицерол: 90% FBS + 10% глицерол

Обмислете закупуването на нашата предварително формулирана среда за замразяване:

Среда за замразяване CM-1: За протоколи, изискващи среда, съдържаща фетално телешко серум (FBS)
Среда за замразяване CM-ACF – без серум: За алтернатива без FBS

Етикетиране и документация

Маркирайте криовиалите със следните данни:

Дата
Име на изследователя
Номер на клетката
Номер на пасажа
Тип на клетките
Допълнителна информация (например генетични модификации)

Подготовка на клетките

За адхезивни клетки:

Наблюдавайте клетките, докато достигнат 85–95% конфлуентност
Изсмучете старата културална среда
Изплакнете монослоя от клетки с PBS без калций и магнезий
Отделете клетките с Accutase, трипсин или трипсин-EDTA и неутрализирайте с културална среда, ако е необходимо
Прехвърлете клетъчната суспензия в 50 мл епруветка Falcon

За клетки в суспензия:

Проверете плътността и състоянието на клетките под микроскоп
Прехвърлете клетъчната суспензия директно в 50 мл епруветка Falcon

Преброяване на клетките и центрофугиране

Пребройте клетките с помощта на хемоцитометър или автоматичен брояч на клетки
Центрофугирайте при 300 g в продължение на 3–5 минути при стайна температура, за да се утаят клетките
Изсмучете внимателно супернатантата, като избягвате да нарушите утаяката от клетки
Загрейте подготвената среда за замразяване до 37 °C преди употреба

Криоконсервация

Ресуспендирайте утаяката от клетки в замразяващата среда до плътност 2,0 милиона клетки/мл за адхезивни клетки и 5 милиона клетки/мл за суспензионни клетки, или до желаната от вас концентрация
Разпределете 1,0 мл (или повече, ако е необходимо) от клетъчната суспензия в етикетирани криовиали
Използвайте метод за бавно замразяване, преди да прехвърлите клетките за дългосрочно съхранение

? Метод: ? Стъпки
❄️ Ръчно замразяване: 1️⃣ Поставете клетките в замразяваща среда във фризер при 4 °C за 40 минути.
2️⃣ Прехвърлете във фризер при -80 °C за 24 часа.
3️⃣ Съхранявайте клетките в течен азот за дългосрочно съхранение.
? Използване на Mr. Frosty: 1️⃣ Подгответе клетките в криовиали с замразяваща среда.
2️⃣ Поставете криовиалите в контейнера Mr. Frosty.
3️⃣ Съхранявайте при -80°C за 24 часа, преди да ги преместите в течен азот.
? Фризер с контролирана скорост: 1️⃣ Настройте устройството да понижава температурата постепенно.
2️⃣ Поставете подготвените клетки във фризера.
3️⃣ След цикъла на замразяване прехвърлете клетките в течен азот.

Съхранявайте криовиалите при температури под -130 °C или в течен азот за дългосрочно съхранение.

Материали и реагенти

Криовиали от 1–2 мл
Замразяващо устройство CoolCell® или фризер с контролирана скорост
Криозащитна среда за замразяване (напр. DIY криозащитна среда, CM-1, CM-ACF или специализирана среда)
Фетално телешко серум (FBS) или кондиционирана среда
DMSO или глицерин
PBS без калций и магнезий
Accutase, трипсин или трипсин-EDTA (за адхезивни клетки)
15 мл или 50 мл епруветки Falcon
Хемоцитометър или автоматичен брояч на клетки
Центрофуга