Изчерпателно ръководство за замразяване на клетки: Осигуряване на жизнеспособност и стерилност

Замразяването на клетки е критичен процес в управлението на клетъчни култури, който осигурява дългосрочно съхранение и опазване на ценни клетъчни линии. Независимо дали се работи с човешки или животински клетки, спазването на точни протоколи и поддържането на строги асептични техники са от първостепенно значение за постигане на успешно криосъхранение.

Това ръководство предоставя подробни инструкции за необходимите материали, реактиви и процедури стъпка по стъпка за ефективно замразяване на клетки, като се запазва тяхната жизнеспособност и стерилност. Като се придържат към тези указания, изследователите могат уверено да съхраняват и по-късно да съживяват клетъчни култури с минимална загуба на жизнеспособност, като запазват целостта и надеждността на експерименталните си резултати.

Като начало е важно да се създаде стерилна работна среда. Правилните асептични техники играят решаваща роля за предотвратяване на замърсяването и гарантиране на стерилността на културите.

Асептична техника

Спазвайте асептични техники по време на целия процес, за да гарантирате стерилността на културите.

Цялостен процес на замразяване на клетки

Тази блок-схема предоставя подробно визуално ръководство за основните стъпки, свързани с правилното замразяване на клетки. Следвайте тези процедури, за да осигурите висока жизнеспособност и цялост на клетките по време на процеса на криоконсервация.

Подготовка на средата за замразяване

Пригответе криопротективна среда за замразяване в зависимост от типа на клетките:

Култури, съдържащи FBS: 90 % FBS + 10 % DMSO или 70 % растежна среда, 20 % FBS и 10 % DMSO
Клетки, изискващи глицерол: 90 % FBS + 10 % глицерол

Обмислете възможността да се сдобиете с нашата предварително формулирана среда за замразяване:

За протоколи, изискващи среда, съдържаща фетален говежди серум (FBS)
Замразяваща среда CM-ACF - без серум: За алтернатива без FBS

Етикетиране и документация

Етикетирайте криовиали със следните данни:

Дата
Име на изследователя
Номер на клетката
Номер на пасажа
Вид на клетката
Всякаква допълнителна информация (напр. генетични модификации)

Подготовка на клетките

За адхезивни клетки:

Наблюдавайте клетките, докато достигнат 85-95 % срастване
Аспирирайте старата хранителна среда
Изплакнете клетъчния монослой с PBS без калций и магнезий
Отделете клетките с Accutase, трипсин или трипсин-EDTA и неутрализирайте с хранителна среда, ако е необходимо
Прехвърлете клетъчната суспензия в 50 ml епруветка Falcon

За суспензионни клетки:

Проверете плътността и здравината на клетките под микроскоп
Прехвърлете клетъчната суспензия директно в 50 мл епруветка Falcon

Преброяване на клетките и центрофугиране

Преброяване на клетките с помощта на хемоцитометър или автоматичен клетъчен брояч
Центрофугиране при 300 g за 3-5 минути при стайна температура, за да се отделят клетките
Внимателно аспирирайте супернатантата, като избягвате нарушаването на клетъчната пелета
Загрейте приготвената среда за замразяване до 37 °C преди употреба

Криоконсервация

Ресуспендирайте клетъчната пелета в среда за замразяване до плътност от 2,0 млн. клетки/мл за адхезивни клетки и 5 млн. клетки/мл за суспензионни клетки или желаната от вас концентрация
Разпределете 1,0 ml (или повече, ако е необходимо) от клетъчната суспензия в етикетирани криовиоли
Използвайте метод за бавно замразяване, преди да прехвърлите клетките за дългосрочно съхранение

? Метод	? Стъпки
❄️ Ръчно замразяване	1️⃣ Поставете клетките в среда за замразяване във фризер с температура 4°C за 40 минути. 2️⃣ Прехвърлете във фризер с температура -80°C за 24 часа. 3️⃣ Съхранявайте клетките в течен азот за дългосрочно запазване
? Използване на Mr. Frosty	1️⃣ Подгответе клетките в криовиали със замразяваща среда. 2️⃣ Поставете криовиолите в контейнера на Mr. Frosty. 3️⃣ Съхранявайте при -80 °C за 24 часа, преди да ги прехвърлите в течен азот
? Фризер с контролирана скорост	1️⃣ Програмирайте устройството за постепенно намаляване на температурата. 2️⃣ Поставете подготвените клетки във фризера. 3️⃣ След цикъла на замразяване прехвърлете клетките в течен азот

Съхранявайте криовиолите при температури под -130 °C или в течен азот за дългосрочно съхранение.

Материали и реактиви

криовиали с вместимост 1-2 ml
Апарат за замразяване CoolCell® или фризер с контролирана скорост
Криопротективна среда за замразяване (напр. криопротективна среда "Направи си сам", CM-1, CM-ACF или специализирана среда)
Фетален говежди серум (FBS) или кондиционирана среда
DMSO или глицерол
PBS без калций и магнезий
Акутаза, трипсин или трипсин-EDTA (за адхезивни клетки)
епруветки Falcon с обем 15 или 50 ml
Хемоцитометър или автоматичен брояч на клетки
Центрофуга