Células HuH7: Uma porta de entrada para a pesquisa sobre o hepatoma e o HCV

A linhagem celular HuH7, derivada de um hepatoma humano, representa uma coleção imortalizada de células tumorigênicas de tipo epitelial. Essa linhagem, juntamente com suas derivadas HuH7.5 e HuH7.5.1, serve como um substituto prático para hepatócitos primários em contextos experimentais. Ela é utilizada predominantemente em modelos de cultura celular para investigar a infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) e a fisiopatologia do hepatoma.

Origem e características das células HuH-7

É essencial compreender as origens, as principais características e as condições ideais de cultura da linha celular HuH-7 antes de sua aplicação em pesquisas.

A linha celular HuH7 foi estabelecida por Sato, J, e Nakabayshi, H, em 1982, derivada de uma linhagem de câncer de hepatócitos altamente diferenciada. Ela foi originalmente isolada de um carcinoma hepatocelular em um homem japonês de 57 anos. Caracterizadas por sua capacidade de produzir várias substâncias fisiologicamente relevantes, como albumina e alfa-fetoproteína, as células HuH7 apresentam alta suscetibilidade à infecção pelo HCV, tornando-as adequadas para uso em sistemas de replicons do HCV. Essa característica torna a linhagem celular valiosa para a triagem e o desenvolvimento de terapêuticas anti-HCV. As células HuH7 apresentam uma morfologia semelhante à epitelial, com formato hexagonal, e aderem às superfícies para formar monocamadas 2D durante o crescimento. Em média, as células HuH7 têm um diâmetro de 21,9 µm, tendendo a uma aparência maior e achatada. A linhagem celular HuH7 é caracterizada por um número heterogêneo de cromossomos, variando tipicamente entre 55 e 63, o que reflete a variabilidade genética dentro da população celular. Essa heterogeneidade é consequência das pressões seletivas encontradas durante a cultura celular e pode variar de acordo com as diferentes condições laboratoriais.

Análise comparativa: linhas celulares HuH7 vs. HuH7.5

A linhagem celular HuH7.5, derivada da HuH7, difere principalmente devido a uma mutação missense no gene RIG-I (DDX58), crucial para a resposta antiviral intracelular. Essa mutação aumenta a permissividade das células HuH7.5 para a replicação do RNA genômico e subgenômico do HCV, distinguindo-a da linha celular parental HuH7 em termos de sua utilidade na pesquisa virológica.

Cultivo de células HuH7: protocolos essenciais para um crescimento ideal

As células HuH7, essenciais para uma infinidade de estudos de pesquisa, requerem condições precisas de cultura para se desenvolverem adequadamente. Esta seção aborda os aspectos fundamentais da cultura de células HuH7, garantindo a manutenção de sua relevância fisiológica em investigações científicas.

Dinâmica do tempo de duplicação

O tempo de duplicação das células HuH7 é normalmente de 24 horas, embora variações nos meios de cultura celular possam estender esse período para 36 a 48 horas, destacando a influência das condições ambientais na proliferação celular.

Características de adesão

As células HuH7 formam predominantemente uma monocamada bidimensional, aderindo às superfícies de placas e frascos de cultura, o que ressalta sua preferência por um substrato físico estável em detrimento de culturas em suspensão.

Densidade ideal de semeadura

Manter a confluência das células HuH7 na faixa de 30 a 90% é fundamental para evitar uma queda nas taxas de proliferação quando a confluência ultrapassa 90%. A subcultura com Accutase facilita o desprendimento, permitindo a semeadura em densidades adaptadas às necessidades experimentais, variando de níveis ótimos (2×10⁴ células/cm²) até níveis de saturação (6×10⁴ células/cm²).

Necessidades nutricionais

O Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) proporciona um ambiente nutricional ideal para as células HuH7. A renovação regular do meio, idealmente 2 a 3 vezes por semana, é crucial para a saúde celular sustentada.

Condições ambientais

Uma incubadora umidificada, ajustada para 5% de CO₂ e 37 °C, oferece condições ideais para a cultura de células HuH7, simulando condições fisiológicas propícias às atividades celulares.

Armazenamento de longo prazo

Para preservação prolongada, as células HuH7 devem ser armazenadas na fase de vapor de nitrogênio líquido, garantindo sua viabilidade para pesquisas futuras.

Criopreservação e recuperação

O uso de uma técnica de congelamento gradual é fundamental para manter a viabilidade celular durante a criopreservação. As células devem ser suspensas em um meio de congelamento especificamente projetado, como o CM-1, garantindo uma transição suave para o armazenamento criogênico. Após o descongelamento, uma reativação rápida, porém suave, em banho-maria a 37 °C, seguida de centrifugação para descartar o meio de congelamento e ressuspensão em meio de crescimento fresco, é essencial para restabelecer as culturas celulares.

Considerações de biossegurança

Recomenda-se seguir um protocolo de Nível 1 de Biossegurança para o manuseio e a propagação da linhagem celular HuH7, em conformidade com os padrões de segurança e ética em ambientes laboratoriais.

Ao seguir essas condições de cultura meticulosamente descritas, os pesquisadores podem garantir o crescimento robusto e a relevância fisiológica das células HuH7 em suas explorações científicas, abrindo caminho para descobertas revolucionárias na pesquisa sobre hepatoma e o vírus da hepatite C.

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Células HuH7: vantagens e desvantagens

A linhagem celular HuH7 apresenta, ao mesmo tempo, vantagens e limitações. Vamos examinar os possíveis prós e contras dessa linhagem celular, pois isso pode ajudá-lo a decidir se ela é adequada para seus experimentos.

Vantagens da linha celular HuH7

As células HuH7 possuem muitas características que as tornam atraentes para uso em pesquisa.

• Fácil propagação: Ao contrário de outras linhagens celulares de hepatoma humano, a linhagem celular HuH7 pode ser cultivada facilmente sem a adição de soro; no entanto, a CLS recomenda o uso de RPMI 1640 com 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina. As células HuH-7 secretam um fator de crescimento que auxilia no crescimento celular sem soro.
• Flexibilidade de transfecção: A linha celular HuH7 é amplamente utilizada para fins de transfecção devido à sua alta receptividade ao genoma do HCV. Portanto, essas células são fundamentais para a triagem e o desenvolvimento de medicamentos anti-HCV.
• Alternativa aos hepatócitos humanos: A linhagem celular HuH7 é um excelente substituto para os hepatócitos humanos. Ela pode ajudar os pesquisadores a estudar transportadores hepáticos de medicamentos e compreender a interação de certos medicamentos com as MRPs (proteínas associadas à resistência a múltiplos medicamentos).
• Desenvolvimento de um modelo de xenoenxerto em camundongos: As células HuH7 têm sido utilizadas para produzir um modelo de xenoenxerto em camundongos originado a partir da linha celular. Esse modelo animal pode fornecer informações valiosas aos pesquisadores sobre inibidores de proteína quinase e terapias anticâncer.
• Pesquisa sobre câncer: A linhagem celular HuH7 é uma linhagem de células cancerosas do fígado humano, que auxilia os pesquisadores a realizar estudos sobre o câncer de fígado.

Limitações da linha celular HuH-7

Existem algumas limitações associadas ao cultivo da linhagem celular HuH7.

Contaminação microbiana: A contaminação bacteriana é o problema mais comum na cultura celular. Quando ocorre uma infecção, ela pode ser identificada pela alteração do pH e pela turbidez do meio de cultura. Entre as contaminações bacterianas, a contaminação por micoplasma geralmente não é aparente. No entanto, ela afeta lentamente a morfologia, a expressão gênica e outras características da linhagem celular.

Período de cultura: Embora a linha celular HuH-7 seja imortal, exceder o período de cultura pode afetar gradualmente a saúde das células. Isso pode afetar a taxa de proliferação e a expressão gênica, o que pode reduzir a reprodutibilidade dos resultados. Para a linha celular HuH-7, o número de passagens deve ser mantido abaixo de 20–25.

Aplicações das células HuH-7

Essa linha celular derivada de hepatoma humano oferece diversas aplicações em pesquisa. A seguir, descrevemos algumas áreas de pesquisa que utilizam a linha celular HuH7.

1. Resistência a medicamentos: A HuH7 é uma linhagem celular de carcinoma hepatocelular (CHC) que pode ser utilizada para estudar a resistência a medicamentos em potenciais tratamentos contra o câncer de fígado. Um estudo realizado em 2021 utilizou células HuH7, que foram tornadas experimentalmente resistentes ao sorafenibe, para desenvolver novas e eficazes terapêuticas, ou seja, peptídeos de auto-montagem que se acumulam nas mitocôndrias.

2. Insights genéticos e perfil molecular por meio das células HuH7: As distintas linhas celulares HuH7, incluindo vários derivados e variantes, permitiram uma compreensão mais profunda da expressão gênica e do papel de marcadores genômicos específicos na doença. Técnicas como a espectroscopia Raman, defendida por pesquisadores como Evgeny Gladilin, foram aplicadas às células HuH7 para a elaboração de perfis moleculares e celulares, revelando insights sobre a resposta celular à infecção viral. O potencial da espectroscopia Raman, combinado com métodos como a proteômica quantitativa, facilitou a exploração das respostas das células-hospedeiras, incluindo a resposta do interferon e as alterações nas gotículas lipídicas, que são fundamentais para a compreensão da replicação do HCV e do efeito da SARS. A expressão de diferentes marcadores oncogênicos pode ser investigada para compreender seu comportamento em resposta a qualquer tratamento, como em um estudo que utilizou células HuH7 para investigar o efeito do composto kaempferol no padrão de expressão dos genes da MMP9 e da via AKT. Essas vias regulam a metástase e a invasividade do carcinoma hepatocelular. Outro estudo recente também investigou o papel do gene da cascata de sinalização Wnt/β-catenina na sobrevivência e no crescimento de células de HCC.

3. Desenvolvimento de medicamentos: as células HuH7 são amplamente utilizadas em estudos de triagem e desenvolvimento de medicamentos contra o câncer de fígado. Vários estudos foram realizados para investigar o potencial inibitório de diversos extratos vegetais, compostos de origem vegetal, nanopartículas e outros agentes terapêuticos contra o HCC. Um estudo realizado em 2022 analisou as propriedades pró-apoptóticas e anticancerígenas de um radionuclídeo contra o carcinoma hepatocelular utilizando uma linhagem celular HuH7.

4. Células HuH7: Um ponto central na pesquisa viral e na análise celular As células HuH7 tornaram-se um pilar no estudo da infecção viral e das doenças infecciosas, particularmente do vírus da hepatite C (HCV) e de suas interações com coronavírus como o SARS-CoV-2, responsável pela doença coronavírus 2019 (COVID-19). O desenvolvimento de sistemas experimentais de cultura celular do HCV (HCVcc) utilizando células HuH7 avançou significativamente nossa capacidade de estudar o complexo processo de replicação do HCV e os fatores do hospedeiro essenciais para a infecção pelo HCV. Isso inclui a análise da eficiência da replicação do RNA do HCV e da produção de viriões infecciosos. As distintas linhagens de células HuH7, incluindo variantes senescentes e infectadas, oferecem um painel diversificado para investigar a multiplicidade de infecção, a propagação viral e os mecanismos de inibição contra vírus como o SARS.

Em resumo, o estudo das células HuH7 abrange um amplo espectro de investigações científicas, desde os mecanismos moleculares subjacentes às infecções virais até as respostas celulares detalhadas provocadas por esses patógenos. Por meio das pesquisas com as células HuH7, a comunidade científica continua a desvendar a complexa dinâmica das interações hospedeiro-vírus, contribuindo para o avanço das estratégias antivirais e para nossa compreensão dos determinantes celulares nas doenças virais.

Publicações sobre HuH-7

Há uma infinidade de publicações que utilizam a linhagem celular HuH7 para diferentes fins. Aqui, mencionamos algumas publicações recentes e significativas.

• Aplicação de peptídeos de auto-montagem direcionados às mitocôndrias como um novo tratamento para células de carcinoma hepatocelular resistentes ao sorafenibe.

Este estudo foi publicado na revista *Nature Scientific Reports* em 2021. O estudo utilizou células de carcinoma hepatocelular resistentes ao sorafenibe induzidas experimentalmente (linha celular HuH-7) para investigar os efeitos pró-apoptóticos e antitumorais do Mito-FF (peptídeos de auto-montagem que se acumulam nas mitocôndrias), desenvolvido recentemente.

• O kaempferol inibe a migração celular de células de carcinoma hepatocelular humano ao suprimir a MMP-9 e a sinalização da Akt

Este artigo foi publicado na revista Environmental Toxicology por Po-Chung Ju e colegas em 2021. Neste estudo, os pesquisadores exploraram o potencial antimetastático de um composto de origem vegetal, o kaempferol, contra células de carcinoma hepatocelular (HuH7). Além disso, eles também estudaram as vias de sinalização que regulam a metástase e a invasão das células cancerosas do fígado.

• A dafnetina inibe a sobrevivência de células de carcinoma hepatocelular por meio da regulação da via de sinalização Wnt/β-catenina

Este artigo foi publicado na revista Drug Development Research em 2022. Este estudo explica o papel anticâncer do composto daphnetina contra o HCC. Esse composto de origem vegetal inibe a sinalização Wnt/β-catenina para restringir o crescimento das células cancerosas.

• O RGFP966 suprime o crescimento e a migração tumoral por meio da inibição da expressão do EGFR em células de carcinoma hepatocelular in vitro

Este artigo de pesquisa, publicado na revista *Drug Design, Development, and Therapy*, descreve o papel da sinalização do EGFR no crescimento e na metástase do carcinoma hepatocelular. O estudo utilizou células HuH7 para investigar o efeito inibitório do RGFP966, um inibidor da histona desacetilase 3 (HDAC3), contra o HCC por meio da supressão de genes da via do EGFR.

• O perrenato de rênio (188ReO₄) induziu apoptose e reduziu o fenótipo canceroso em células de câncer de fígado

Esta publicação na revista *Cells* indica o uso de células HuH7 na investigação do potencial anti-HCC de um radionuclídeo, ou seja, o perrenato de rênio.

• Atividade antiviral de nanopartículas de quitosana encapsulando curcumina contra o vírus da hepatite C do genótipo 4a em linhagens celulares de hepatoma humano

Este estudo foi publicado no International Journal of Nanomedicine. O estudo utilizou células HuH7 para explorar a atividade antiviral de nanopartículas de quitosana contendo curcumina contra o genótipo 4a do HCV.

Recursos sobre HuH-7: protocolos, vídeos e muito mais

Existem muitos recursos disponíveis para o cultivo e a manutenção da linhagem celular HuH7. Aqui, você conhecerá os recursos disponíveis que explicam os protocolos de cultivo celular e transfecção para HuH7, além de vídeos educativos.

Protocolos de cultura celular

Os recursos a seguir podem ajudá-lo a dar os primeiros passos no cultivo e na manutenção da linha celular HuH7.

• Informações e recursos sobre cultura de células HuH-7: Este site contém muitas informações úteis, incluindo o protocolo de subcultura da linha celular HuH-7, seu armazenamento e seu manuseio.

• Protocolo de cultura celular HuH7

Protocolos de transfecção de HuH7

As células HuH7 são transfectadas de diversas maneiras. Os recursos a seguir fornecem uma grande quantidade de informações sobre protocolos de transfecção, reagentes e produtos químicos necessários, dicas úteis e precauções.

Vídeos relacionados à linha celular HuH7

Há muitos vídeos educativos disponíveis sobre protocolos básicos de subcultivo, semeadura e transfecção, entre outros.

• Passagem de células: Noções básicas de cultura celular: Este vídeo trata do protocolo básico de cultura para a linha celular.

Esperamos que as informações fornecidas neste artigo ajudem você a adquirir conhecimentos básicos e avançados sobre a linha celular HuH7 antes de trabalhar com ela. Se desejar utilizar essas células em seu trabalho de pesquisa, você pode fazer seu pedido conosco.

Perguntas frequentes sobre a linha celular HuH7 e pesquisas virais