Meios de cultura celular: uma visão geral

No campo das ciências da vida, uma das metodologias mais importantes é a cultura celular. A remoção de células, tecidos ou órgãos de um animal ou planta e a subsequente implantação dessas células, tecidos ou órgãos em um ambiente artificial favorável à sua sobrevivência e/ou crescimento é o que se entende pela expressão “cultura celular”. As necessidades ambientais fundamentais para o desenvolvimento celular ideal são: temperatura controlada, um substrato para a adesão celular, um meio de crescimento adequado e uma incubadora que mantenha o pH e a osmolalidade ideais. As células precisam dessas condições para crescerem em todo o seu potencial.

A seleção de um meio de crescimento adequado para o cultivo in vitro é a etapa da cultura celular que é ao mesmo tempo a mais crítica e a mais vital. Um meio de crescimento, também conhecido como meio de cultura, é um líquido ou gel formulado para estimular o desenvolvimento de organismos em escala microscópica, celular ou vegetal. O meio utilizado para o cultivo de células geralmente contém um suprimento adequado de energia e substâncias que controlam o ciclo celular. Os principais componentes de um meio de cultura incluem aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos, glicose e soro. O soro é adicionado ao meio porque atua como fonte de fatores de crescimento, hormônios e fatores de adesão. Além de fornecer nutrientes, o meio também contribui para a manutenção dos níveis de pH e osmolalidade.

Tipos de meio utilizados na cultura celular

Tanto as células humanas quanto as animais podem ser cultivadas em um meio artificial ou sintético, ou em um meio inteiramente natural, suplementado com elementos naturais. A seguir, apresentaremos uma visão geral dos diferentes tipos de meios disponíveis atualmente.

Meios naturais

Apenas fluidos biológicos que existem em seu estado natural podem ser encontrados em meios naturais. Os meios naturais são muito úteis e fáceis para o cultivo de uma ampla variedade de tipos de células animais. A falta de compreensão dos componentes precisos que compõem os meios naturais é o principal fator que contribui para a baixa repetibilidade dos resultados obtidos com o uso desses meios.

Meios artificiais

A preparação de meios artificiais ou sintéticos envolve a adição de nutrientes (tanto orgânicos quanto inorgânicos), proteínas séricas, carboidratos, cofatores, vitaminas e sais, bem como as fases gasosas de O₂ e CO₂ [1].

Vários tipos de meios artificiais foram desenvolvidos com o objetivo de cumprir uma ou mais das seguintes funções: 1) Sobrevivência imediata (uma solução salina balanceada com pH e pressão osmótica precisos). 2) Sobrevivência prolongada (uma solução salina balanceada suplementada com diferentes formulações de compostos orgânicos e/ou soro). 3) Desenvolvimento por tempo indeterminado. 4) Funções especializadas.

Existem quatro classificações distintas para meios artificiais:

Meios contendo soro

O tipo mais comum de suplemento encontrado em meios utilizados para o cultivo de células animais é o soro fetal bovino. Ele é adicionado ao meio de cultura como um suplemento de baixo custo, a fim de alcançar as melhores condições de crescimento possíveis. Além de atuar como transportador ou quelante de nutrientes instáveis ou insolúveis em água, hormônios e fatores de crescimento, inibidores de protease e outras substâncias, o soro também se liga a moléculas nocivas e as neutraliza.

Meio sem soro

A presença de soro nos meios de cultura apresenta várias desvantagens e tem o potencial de causar erros graves de interpretação em pesquisas imunológicas [2, 3]. Já foram criados diversos meios de cultura sem soro [4, 5]. Esses meios são geralmente formulados especificamente para apoiar a cultura de um único tipo de célula, como o Knockout Serum Replacement e o Knockout DMEM da Thermo Fisher Scientific, e o meio mTESR da Stem Cell Technologies [6], para células-tronco [7].

Além disso, esses meios incorporam quantidades definidas de fatores de crescimento purificados, lipoproteínas e outras proteínas, que, de outra forma, seriam normalmente fornecidas pelo soro [8]. Esses meios são frequentemente chamados de “meios de cultura definidos”, uma vez que os componentes que os compõem são bem compreendidos.

Meios quimicamente definidos

Esses meios incluem componentes inorgânicos e orgânicos ultrapuros que não foram contaminados por nenhum tipo de contaminação. Eles também podem incluir adições de proteínas puras, como fatores de crescimento.

 A modificação genética de bactérias ou leveduras, juntamente com a adição de ácidos graxos específicos, vitaminas, colesterol e aminoácidos, resulta na produção de seus componentes [9].

Meios livres de proteínas

Meios livres de proteínas são aqueles que não contêm nenhuma proteína e, em vez disso, incluem apenas elementos não proteicos. Quando comparados a meios com soro adicionado, o uso de meios sem adição de proteínas promove maior proliferação celular e expressão proteica, além de facilitar a purificação de qualquer produto gerado em um processo posterior [10-12]. A proteína não está incluída em formulações como MEM e RPMI-1640. No entanto, um suplemento proteico pode ser administrado, se necessário.

Meios de cultura e seus componentes básicos

Os meios de cultura comerciais podem ser adquiridos na forma de pó ou líquido e, frequentemente, incluem uma variedade de nutrientes, como aminoácidos, glicose, sais, vitaminas e outros suplementos alimentares. 

As necessidades desses componentes variam de acordo com cada linhagem celular, e essas variações são responsáveis pela grande diversidade de formulações de meios. Cada componente é responsável por uma determinada função, que será descrita nos parágrafos a seguir:

Sistemas tampão

Para manter condições ideais de crescimento, o pH deve ser controlado, o que geralmente é feito por um dos dois sistemas tampão:

Sistema tampão natural

A proporção de CO₂/H₂CO₃ na atmosfera é igual à do meio, criando um mecanismo tampão natural. Para preservar esse mecanismo tampão natural, as culturas devem ser mantidas em um ambiente com 5 a 10% de CO₂, o que geralmente é obtido por meio do uso de uma incubadora de CO₂. Uma das principais vantagens do uso de um tampão natural é o fato de ser barato e seguro.

HEPES

A tamponagem química utilizando o zwiterião HEPES apresenta maior capacidade de tamponamento na faixa de pH de 7,2 a 7,4 e não requer um ambiente gasoso regulado. Para determinados tipos de células, uma dose maior de HEPES pode ser prejudicial. Meios contendo HEPES são, da mesma forma, muito mais suscetíveis aos efeitos fototóxicos da luz fluorescente [13].

Vermelho de fenol

O indicador de pH vermelho de fenol é frequentemente incluído em meios de cultura disponíveis comercialmente, permitindo o monitoramento contínuo do pH. À medida que as células se proliferam, os metabólitos produzidos por elas causam uma alteração no pH e, consequentemente, uma mudança na cor do meio. O vermelho de fenol tem um efeito duplo na cor do meio, tornando-o amarelo em pH ácido e roxo em pH alcalino. O pH 7,4, valor ideal para cultura celular, faz com que o meio apresente uma cor vermelha fluorescente.

No entanto, o vermelho de fenol apresenta algumas desvantagens: em primeiro lugar, ele é capaz de simular a ação de vários hormônios esteróides, principalmente o estrogênio [14]. Portanto, ao estudar células sensíveis ao estrogênio, como o tecido mamário, recomenda-se o uso de um meio sem vermelho de fenol. O equilíbrio sódio-potássio é prejudicado pela presença do vermelho de fenol em várias formulações sem soro. A adição de soro ou do hormônio hipofisário bovino aos meios pode neutralizar esse efeito [15]. Em terceiro lugar, a detecção em experimentos de citometria de fluxo é dificultada pela presença do vermelho de fenol.

Sais inorgânicos

Meios que contêm sais inorgânicos, como íons de sódio, potássio e cálcio, ajudam a manter o equilíbrio osmótico e a regular o potencial de membrana.

Aminoácidos

Como os aminoácidos são os componentes fundamentais das proteínas, eles são um componente essencial de todos os meios de crescimento celular já concebidos. Como as células são incapazes de produzir certos aminoácidos por conta própria, é importante que o meio de cultura inclua aminoácidos essenciais. Eles são necessários para a proliferação celular, e a concentração em que estão presentes determina a densidade celular máxima que pode ser alcançada. Em particular, a L-glutamina, um aminoácido essencial, é especialmente crucial.

A L-glutamina atua como fonte secundária de energia para o metabolismo e fornece nitrogênio para a produção de NAD, NADPH e nucleotídeos. Como a L-glutamina é um aminoácido instável que, com o tempo, se transforma em uma forma que as células não conseguem utilizar, ela deve ser adicionada ao meio.

Além disso, aminoácidos não essenciais podem ser fornecidos ao meio a fim de repor aqueles que foram consumidos ao longo do processo de crescimento. O crescimento das células é estimulado e sua viabilidade é aumentada quando o meio de crescimento é suplementado com aminoácidos não essenciais.

Carboidratos

Os carboidratos na forma de açúcares são a principal fonte de energia. Muitos dos meios também incluem maltose e frutose, além dos açúcares mais comuns, como glicose e galactose.

Proteínas e peptídeos

A albumina, a transferrina e a fibronectina são as proteínas e os peptídeos mais comumente utilizados. Elas são especialmente importantes em meios que não contêm soro. A albumina, a transferrina, a aprotinina, a fetuína e a fibronectina são algumas das proteínas que podem ser encontradas no soro, que é uma fonte rica em proteínas.

A albumina é a principal proteína encontrada no sangue, e sua função é ligar e transportar várias substâncias — incluindo água, sais, ácidos graxos livres, hormônios e vitaminas — entre diferentes órgãos e células. A capacidade da albumina de se ligar a substâncias químicas a torna uma candidata eficaz para remover compostos nocivos do meio em que as células são cultivadas.

A aprotinina é um agente protetor em sistemas de cultura celular, uma vez que é estável em pH neutro e ácido, além de ser resistente a altas temperaturas e à destruição que pode ser causada por enzimas proteolíticas. É capaz de inibir diversas proteases de serina, incluindo a tripsina, entre outras.

A fetuína é uma glicoproteína que pode ser detectada em quantidades maiores no soro de animais fetais e recém-nascidos em comparação com o soro de adultos. Além disso, atua como inibidor de proteases de serina. A proteína fibronectina é um componente essencial no processo de adesão celular. A transferrina é uma proteína que transporta ferro e é responsável por levá-lo às membranas celulares.

Ácidos graxos e lipídios

Eles desempenham um papel crucial no meio sem soro, quando o soro está ausente.

Vitaminas

Inúmeras vitaminas são necessárias para o desenvolvimento e a proliferação celular. As vitaminas não podem ser produzidas em quantidades adequadas pelas células e, portanto, são essenciais na cultura de tecidos como suplementos alimentares.

Na cultura celular, o soro é a principal fonte de vitaminas; no entanto, os meios também são enriquecidos com diversas vitaminas para torná-los adequados a um tipo específico de célula. Normalmente, as vitaminas do complexo B são utilizadas para estimular o crescimento.

Oligoelementos

Elementos químicos como cobre, zinco, selênio e intermediários do ácido tricarboxílico são conhecidos como oligoelementos. Os oligoelementos são frequentemente adicionados a meios que não contêm soro, a fim de substituir aqueles que normalmente estão presentes no soro. Esses elementos são componentes químicos importantes, necessários para o desenvolvimento saudável das células. Muitas reações bioquímicas dependem de certos micronutrientes, como a atividade enzimática.

Suplementos para meios de cultura

O meio de crescimento completo recomendado para determinadas linhagens celulares requer componentes adicionais que não estão presentes no meio de base nem no soro. Esses suplementos alimentares apoiam o crescimento celular e o funcionamento metabólico adequado.

Embora hormônios, fatores de crescimento e moléculas de sinalização sejam essenciais para a proliferação adequada de determinadas linhagens celulares, as seguintes precauções devem ser sempre tomadas: como a adição de suplementos pode alterar a osmolalidade do meio de crescimento completo, o que pode inibir o desenvolvimento celular, é sempre aconselhável verificar a osmolalidade após a adição dos suplementos. Para a maioria das linhagens celulares, a osmolalidade ideal varia entre 260 e 320 mOSM/kg.

Antibióticos

Os antibióticos são frequentemente empregados para inibir o desenvolvimento de contaminantes bacterianos e fúngicos [16], embora não sejam essenciais para o crescimento celular. Como os antibióticos podem mascarar a contaminação por micoplasmas e bactérias resistentes, seu uso rotineiro não é recomendado para cultura celular [17, 18].

Além disso, os antibióticos podem perturbar o metabolismo de células hipersensíveis. As combinações de penicilina e estreptomicina fabricadas pela MilliporeSigma e pela Life Technologies são frequentemente utilizadas. A plasmocina tem sido utilizada na cultura das linhagens celulares de glioma TS603, TS516 e BT260 [19], e demonstrou-se eficaz na remoção da contaminação por micoplasma (20).

Soro

O soro contém albuminas, fatores de crescimento e inibidores de crescimento. O soro é um dos componentes mais importantes do meio de cultura celular, pois fornece aminoácidos, proteínas, vitaminas (especialmente as lipossolúveis, como A, D, E e K), carboidratos, lipídios, hormônios, fatores de crescimento, minerais e oligoelementos.

O soro de origem fetal e de bezerro é frequentemente utilizado para promover o desenvolvimento de células em cultura. O soro fetal é uma fonte abundante de fatores de crescimento e é adequado para a clonagem celular e o desenvolvimento de células sensíveis. Devido à sua capacidade reduzida de promover o crescimento, o soro de bezerro é empregado em experimentos de inibição por contato. Meios de crescimento normais geralmente incluem de 2% a 10% de soro. A adição de soro ao meio de cultura tem os seguintes objetivos [21]:

• O soro fornece os nutrientes essenciais para as células (tanto em solução quanto ligados a proteínas).

• Vários fatores de crescimento e hormônios envolvidos na promoção do crescimento e na atividade celular especializada estão presentes no soro.

• Ele oferece muitas proteínas de ligação, como a albumina e a transferrina, que transportam outras substâncias químicas para dentro da célula. Por exemplo, a albumina transporta gorduras, vitaminas, hormônios etc. para as células.

• Ele também fornece proteínas, como a fibronectina, que aumentam a adesão celular ao substrato. Além disso, produz elementos de espalhamento que auxiliam na expansão celular antes da divisão.

• Ele fornece inibidores de protease que impedem a proteólise nas células.

• Ele também contém minerais como Na+, K+, Zn2+ e Fe2+.

• Aumenta a viscosidade do meio, protegendo assim as células contra lesões mecânicas durante a agitação na cultura em suspensão.

• Ela também atua como tampão.

Referências

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrição de células animais em cultura de tecidos; estudos iniciais sobre um meio sintético. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Adsorção rápida de um componente do soro fetal bovino por células de mamíferos em cultura. Uma fonte potencial de artefatos em estudos de antisoros contra antígenos específicos de células. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Adição de soro ao meio utilizado para a preparação de suspensões celulares como possível fonte de artefatos em reações mediadas por células estudadas por meio do teste do linfonodo poplíteo. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Meios comerciais sem soro: crescimento de hibridomas e produção de anticorpos monoclonais. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Métodos para o crescimento de células cultivadas em meio sem soro. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. As chaperonas HSP70 transportam a TDP-43, livre de RNA, para invólucros esféricos líquidos intranucleares anisotrópicos. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. A senescência induzida pela síndrome de Down perturba a arquitetura nuclear dos progenitores neurais. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Substituição completa do soro por albumina, transferrina e lipídios de soja em culturas de linfócitos B reativos ao lipopolissacarídeo. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Aprimoramento sistemático de um meio quimicamente definido e livre de proteínas para o crescimento de hibridomas e a produção de anticorpos monoclonais. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Um meio livre de proteínas para o crescimento de hibridomas e outras células do sistema imunológico. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Cultura celular sem soro: uma abordagem unificadora. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Crescimento clonal de linhagens celulares de hamster chinês em meios isentos de proteínas. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Análise dos efeitos citotóxicos de meio de cultura contendo HEPES exposto à luz. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. O vermelho de fenol em meios de cultura de tecidos é um estrogênio fraco: implicações para o estudo de células sensíveis ao estrogênio em cultura. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Desenvolvimento de meios livres de soro. Em: Master JRW, editor. Animal Cell culture, 3ª ed. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Uso de antibióticos em meios de cultura celular. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Propagação e controle da infecção por micoplasma em culturas celulares. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Troca de meio e passagem de linhagens celulares. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. A desmetilase de histonas KDM6A detecta diretamente o oxigênio para controlar a cromatina e o destino celular. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Eficiência do Plasmocin™ em diversas linhagens de células de mamíferos infectadas por mollicutes, em comparação com antibióticos comumente utilizados em cultura celular: uma experiência local. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Aspectos moleculares da ligação de ligantes à albumina sérica. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53