Células primárias humanas

O que são células primárias humanas?

As células primárias são a representação mais pura de seus respectivos tecidos. Elas são isoladas do tecido e processadas para que possam se estabelecer em um ambiente de cultura com condições ideais. Elas imitam mais fielmente o estado in vivo e apresentam fisiologia normal, pois são derivadas do tecido, em vez de serem modificadas. Por isso, podem servir como modelos úteis para pesquisas em farmacologia celular, toxicologia e fisiologia (incluindo estudos sobre metabolismo, envelhecimento e transdução de sinais). É importante lembrar que as células primárias são mais difíceis de cultivar e manter do que uma linhagem celular contínua, pois têm uma vida útil mais curta e param de se dividir (ou envelhecem) após um certo número de divisões celulares. Os estudos das vias de sinalização celular são complicados pela variabilidade inerente às células primárias obtidas de doadores e pelas práticas de subcultura. Antes de iniciar estudos de sinalização, os pesquisadores costumam realizar uma triagem para determinar se as células respondem ou não a estímulos comumente utilizados. Para evitar desperdício de tempo e dinheiro, as células primárias podem ser estimuladas para ativar as principais vias de sinalização antes de serem submetidas à triagem.

Por que usar células primárias humanas?

Linhas celulares imortalizadas são comumente utilizadas em ensaios celulares. Embora os cientistas tenham reconhecido que as alterações biológicas decorrentes das linhas celulares podem ser prejudiciais ao estudo de seu significado fisiológico, o uso de células primárias humanas melhora o valor fisiológico dos dados obtidos por meio de culturas celulares, e elas são cada vez mais consideradas importantes para o estudo de processos biológicos, a evolução de doenças e o desenvolvimento de medicamentos.

As células primárias humanas são amplamente utilizadas em estudos in vitro de comunicação intercelular e intracelular, biologia do desenvolvimento e nos mecanismos subjacentes ao câncer, à doença de Parkinson e ao diabetes, entre muitas outras áreas de pesquisa biológica pré-clínica e investigativa. Os pesquisadores há muito tempo utilizam linhagens celulares imortalizadas para estudar a função dos tecidos; no entanto, linhagens celulares com mutações evidentes e anomalias cromossômicas podem não ser bons substitutos para células normais e para o desenvolvimento da doença em seus estágios iniciais. Agora, é possível obter um modelo mais preciso de um tipo específico de célula tecidual utilizando células primárias humanas isoladas desse tecido e mantidas em meios de cultura de células primárias e suplementos.

O que é cultura de células primárias?

Em vez de utilizar linhagens celulares imortalizadas, a cultura de células primárias envolve o cultivo de células diretamente a partir de um organismo multicelular fora do corpo. Em alguns países, como o Reino Unido, há reconhecimento legal de que as culturas de células primárias são mais representativas dos tecidos in vivo do que as linhagens celulares. No entanto, as células primárias precisam do substrato e dos nutrientes adequados para crescer e, após um certo número de divisões, desenvolvem um fenótipo senescente que faz com que parem de se dividir permanentemente. Esses dois fatores motivam a criação de linhagens celulares. Tanto as células primárias imortalizadas naturalmente (por exemplo, células HeLa) quanto as imortalizadas artificialmente (por exemplo, células HEK) podem ser cultivadas indefinidamente em cultura celular.

Células primárias humanas por tipos de tecido

Células epiteliais, fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células endoteliais, células musculares, células imunes e células-tronco, como as células-tronco mesenquimais, estão entre as células primárias humanas mais comumente utilizadas em estudos científicos. Para começar, as culturas são heterogêneas (representando uma mistura dos tipos de células presentes no tecido) e só podem ser mantidas vivas in vitro por um período específico de tempo. A transformação é um processo in vitro que permite que as células primárias humanas sejam manipuladas para subculturas ilimitadas. A transformação pode ocorrer naturalmente ou ser induzida por substâncias químicas ou vírus. Após passar por uma transformação genética, uma cultura primária pode se dividir indefinidamente, dando origem a uma linhagem celular secundária imortalizada, desde que receba nutrientes e espaço suficientes.

Células endoteliais

O tratamento do câncer, a cicatrização de feridas, a pesquisa em sinalização celular, a triagem de alto rendimento e alto conteúdo e a triagem toxicológica são apenas algumas das áreas que podem se beneficiar do uso de células endoteliais primárias como ferramenta de pesquisa.

Queratinócitos

Os queratinócitos, derivados da epiderme da pele humana adulta ou do prepúcio neonatal, desempenham um papel crucial no estudo de doenças de pele como a psoríase e o câncer.

Células epiteliais

De estudos sobre câncer a investigações toxicológicas, as células epiteliais primárias têm se mostrado recursos inestimáveis para modelar as defesas naturais do corpo.

Fibroblastos

A indução de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) e o estudo da cicatrização de feridas são apenas alguns dos muitos usos dos fibroblastos primários.

Células imunes

As células mononucleares do sangue periférico, abreviadas como PBMC, são células mononucleares do sangue com núcleo redondo. Elas incluem principalmente linfócitos e monócitos, que desempenham funções importantes no decorrer de uma resposta imunológica. As células mononucleares do sangue periférico são frequentemente utilizadas para diagnosticar infecções ou para detectar uma possível proteção vacinal. A compreensão da resposta imune celular mediada pelas células T costuma ser crucial.

Melanócitos

Os melanócitos, células especializadas da pele que produzem o pigmento melanina, são úteis como modelos para pesquisas em temas como cicatrização de feridas, toxicidade, melanoma, resposta dérmica à radiação ultravioleta (UV), doenças de pele e cosméticos.

Células-tronco

As células-tronco têm o potencial de se diferenciar em uma ampla variedade de tipos celulares. Devido à sua capacidade de diferenciação, elas oferecem novas oportunidades para a modelagem de tecidos humanos e condições de saúde.

Células-tronco mesenquimais

As células-tronco mesenquimais, também conhecidas como MSCs, podem ser obtidas de diferentes fontes humanas, como medula óssea, gordura (tecido adiposo), tecido do cordão umbilical (gelatina de Wharton) e líquido amniótico (o líquido que envolve o feto), e podem ser expandidas in vitro. Essas células-tronco estromais adultas têm a capacidade de se desenvolver em uma ampla variedade de tipos celulares. Alguns desses tipos celulares incluem células ósseas, células cartilaginosas, células musculares, células neurais, células cutâneas e células da córnea.

Células musculares lisas

Nos órgãos ocos, as células-matriz do músculo liso (SMCs) revestem o interior e medeiam a contratilidade. Além do câncer e de outras doenças, as SMCs podem ser utilizadas para modelar a fibrose hipertensiva.

Células primárias e linhagens celulares

Seja por mutação espontânea, como em linhagens celulares cancerosas transformadas, seja por meio de alteração intencional, como na produção artificial de genes cancerígenos, as linhagens celulares contínuas adquiriram o potencial de se reproduzir infinitamente (imortalizadas). Via de regra, as linhagens celulares contínuas são mais confiáveis e convenientes de se trabalhar do que as células primárias. Elas podem se expandir indefinidamente e fornecer acesso rápido a dados essenciais. O uso de linhagens celulares contínuas apresenta certas limitações, incluindo o fato de serem geneticamente modificadas/transformadas, o que pode alterar características fisiológicas e não corresponder às condições in vivo, além de que isso pode sofrer alterações adicionais ao longo do tempo com um número significativo de passagens.

Avanços na cultura de células primárias

As células primárias têm a notória reputação de serem difíceis de trabalhar. O processo, no entanto, está se tornando mais fácil do que nunca graças aos avanços na cultura de células primárias, à disponibilidade de células primárias comerciais com protocolos totalmente otimizados e a novas técnicas de análise que exigem menos esforço.

A transição da cultura celular bidimensional para a tridimensional é considerada um marco importante na área. A arquitetura específica do tecido, as interações célula-célula e a sinalização mecânica/bioquímica podem ser atenuadas em uma cultura 2D. Assim, há um limite para o valor biológico dessas culturas.

Por outro lado, a cultura celular 3D permite que as células se expandam e interajam com uma estrutura extracelular tridimensional. Isso permite que as células interajam entre si e com a matriz extracelular, tornando as culturas 3D mais relevantes do ponto de vista fisiológico. A precisão desse método na previsão de respostas in vivo o tornou revolucionário em áreas como a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos. Por isso, tecnologias de ponta, como organoides derivados de pacientes e “órgãos em chip”, fornecem modelos altamente contextuais para a triagem e o desenvolvimento de medicamentos.

A geração de células primárias é um gargalo na cultura primária. Geralmente, é necessário um volume maior de tecido para superar esse desafio, o que pode ser difícil de se obter. No entanto, o aprimoramento da sensibilidade analítica está abrindo caminho para soluções. Por exemplo, a necessidade de cultivar grandes quantidades de células primárias é reduzida com o uso da tecnologia de célula única, que inclui sequenciamento, western blotting e citometria de massa.

Perspectivas promissoras para a cultura de células primárias

As dificuldades gerais da cultura de células primárias estão sendo mitigadas pelos avanços tecnológicos. Por sua vez, esse método está rapidamente substituindo outros como o padrão-ouro nos estudos e na prática da biologia celular e molecular. A fabricação de vacinas, a substituição de órgãos, as terapias com células-tronco, a pesquisa sobre o câncer e muito mais devem se beneficiar enormemente dos avanços contínuos na cultura de células primárias.

Dicas e truques para a cultura de células primárias

As necessidades da expansão celular

Os dois métodos mais comuns para o cultivo de células primárias são em suspensão ou em superfície (2D). Algumas células são capazes de flutuar livremente na corrente sanguínea sem nunca aderir a uma superfície (por exemplo, aquelas derivadas do sangue periférico). Diferentes linhagens celulares foram modificadas para se desenvolverem em culturas em suspensão, onde podem atingir densidades inatingíveis em condições de crescimento 2D. As células primárias que precisam de ancoragem para crescer in vitro são chamadas de células aderentes e incluem aquelas encontradas em tecidos sólidos. Para melhorar as propriedades de adesão e fornecer outros sinais necessários para o crescimento e a diferenciação, essas células são normalmente cultivadas em um recipiente plástico plano não revestido, mas, ocasionalmente, em um microportador. Esta última opção pode ser revestida com proteínas da matriz extracelular (como colágeno e laminina). O meio utilizado na cultura celular consiste em um meio básico que foi suplementado com os fatores de crescimento e citocinas adequados. Uma incubadora celular é um tipo especial de incubadora de laboratório usada para cultivar e manter células a uma temperatura específica e em uma mistura de gases específica (normalmente 37 °C, 5% de CO₂ para células de mamíferos). Dependendo do tipo de célula que está sendo cultivada, as condições ideais podem variar bastante. Conforme os tipos de células em cultivo, o meio de crescimento ideal terá uma combinação única de fatores, incluindo, entre outros, pH, concentração de glicose, fatores de crescimento e a presença de outros nutrientes.

A presença de antibióticos no meio de crescimento é crucial durante o estabelecimento da cultura primária para prevenir a contaminação proveniente do tecido hospedeiro. Alguns esquemas de antibióticos incluem uma combinação de gentamicina, penicilina, estreptomicina e anfotericina B. O uso de antibióticos por um período prolongado não é recomendado, no entanto, pois alguns reagentes (como a anfotericina B) podem ser tóxicos para as células a longo prazo.

A maioria das células primárias passa por senescência e deixa de se dividir após um certo número de duplicações populacionais, tornando-se crucial mantê-las vivas após o isolamento. A viabilidade celular a longo prazo requer técnicas especializadas de cultura celular e condições ideais de cultura (incluindo o meio adequado, a temperatura correta, a mistura de gases adequada, o pH correto, a concentração adequada de fatores de crescimento, a presença de nutrientes e a presença de glicose). Como muitos dos fatores de crescimento usados para suplementar os meios de cultura são obtidos a partir de sangue animal (os ingredientes derivados do sangue apresentam risco de contaminação), recomenda-se que seu uso seja minimizado ou totalmente evitado. Também é importante utilizar uma técnica asséptica.

Subcultura e manutenção

Quando as células isoladas aderem à superfície da placa de cultura, isso marca o início da fase de manutenção. A adesão ocorre normalmente 24 horas após o início da cultura. As células devem ser subcultivadas quando atingirem uma determinada porcentagem de confluência e estiverem se replicando ativamente. Como as células pós-confluentes podem sofrer diferenciação e apresentar proliferação mais lenta após a passagem, é melhor subcultivar as culturas de células primárias antes que atinjam 100% de confluência.

A subcultura em meio fresco mantém o crescimento exponencial das células dependentes de ancoragem. A subcultura de monocamadas interrompe as interações intercelulares e intracelulares na superfície celular. Baixas concentrações de enzimas proteolíticas, como tripsina/EDTA, são empregadas para extrair células primárias aderentes de monocamadas ou tecidos. Após serem dissociadas e diluídas em uma solução de célula única, as células são contadas e transferidas para recipientes de cultura novos para se readerirem e se multiplicarem.

Criopreservação e recuperação

A criopreservação preserva células vivas por meio do congelamento a baixas temperaturas. A criopreservação e o descongelamento de células primárias humanas evitam a morte celular e danos durante o armazenamento e o uso. As células primárias humanas são crioprotegidas com DMSO ou glicerol (na temperatura correta e com uma taxa controlada de congelamento). O processo de congelamento deve ser progressivo, a -1 °C por minuto, para evitar a formação de cristais de gelo. O armazenamento de longo prazo requer nitrogênio líquido (-196 °C) ou temperaturas abaixo de -130 °C.

Basta submergir as células congeladas em um banho-maria a 37 °C por cerca de 1 a 2 minutos para descongelar as células criopreservadas. As células primárias humanas não devem ser centrifugadas após serem retiradas do congelador (pois são extremamente sensíveis a danos durante a recuperação da criopreservação). É adequado para o semeio das células imediatamente após o descongelamento e promove a adesão nas culturas durante as primeiras 24 horas após o semeio. 1 Após a adesão das células primárias criopreservadas, o meio usado deve ser removido (já que o DMSO é prejudicial às células primárias e pode causar uma queda na viabilidade pós-descongelamento).