מצעי גידול תאים: סקירה כללית

בתחום מדעי החיים, אחת המתודולוגיות החשובות ביותר היא תרבית תאים. המונח "תרבית תאים" מתייחס להוצאת תאים, רקמות או איברים מבעל חיים או מצמח, והשתלתם לאחר מכן בסביבה מלאכותית המתאימה להישרדותם ו/או לצמיחתם. הצרכים הסביבתיים הבסיסיים להתפתחות תאים מיטבית הם טמפרטורה מבוקרת, מצע להיצמדות התאים, מצע גידול מתאים ואינקובטור השומר על רמת ה-pH והאוסמולריות האופטימלית. על התאים להיות בתנאים אלה כדי שיוכלו לגדול למלוא הפוטנציאל שלהם.

בחירת מצע גידול מתאים לגידול במבחנה היא השלב בתרבית התאים שהוא גם הקריטי ביותר וגם החיוני ביותר. מצע גידול, המכונה גם מצע תרבית, הוא נוזל או ג'ל שנועד לעודד התפתחות של אורגניזמים בקנה מידה מיקרוסקופי, תאי או צמחי. המצע המשמש לגידול תאים מכיל לרוב אספקה מספקת של אנרגיה וחומרים השולטים במחזור התא. המרכיבים העיקריים של מצע תרבית כוללים חומצות אמינו, ויטמינים, מלחים אנאורגניים, גלוקוז וסרום. הסרום מתווסף למצע משום שהוא משמש כמקור לגורמי גדילה, הורמונים וגורמי היצמדות. בנוסף לאספקת חומרים מזינים, המצע תורם גם לשמירה על רמות ה-pH והאוסמולריות.

סוגי התרבית המשמשים בתרבית תאים

ניתן לגדל תאים אנושיים וחייתיים הן במצע מלאכותי או סינתטי והן במצע טבעי לחלוטין, המועשר במרכיבים טבעיים. להלן נציג סקירה כללית של סוגי המצע השונים הזמינים כיום.

מדיום טבעי

בתרבית טבעית ניתן למצוא רק נוזלים ביולוגיים הקיימים במצבם הטבעי. תרבית טבעית מועילה מאוד וקלה לשימוש לגידול מגוון רחב של סוגי תאים מן החי. חוסר ההבנה לגבי המרכיבים המדויקים המרכיבים את התרבית הטבעית הוא הגורם העיקרי התורם לחזרות הנמוכה של התוצאות המתקבלות בשימוש בתרבית טבעית.

מדיום מלאכותי

הכנת מצעים מלאכותיים או סינתטיים כרוכה בהוספת חומרים מזינים (אורגניים ואורגניים כאחד), חלבוני סרום, פחמימות, קופקטורים, ויטמינים ומלחים, וכן שלבי גז של O₂ ו-CO₂ [1].

פותחו סוגים שונים של מצעים מלאכותיים על מנת למלא תפקיד אחד או יותר מהבאים: 1) הישרדות מיידית (תמיסת מלח מאוזנת עם pH ולחץ אוסמוטי מדויקים). 2) הישרדות ממושכת (תמיסת מלח מאוזנת בתוספת תרכובות שונות של חומרים כימיים אורגניים ו/או סרום). 3) התפתחות בלתי מוגבלת. 4) פונקציות מיוחדות.

יש ארבע סיווגים נפרדים למדיום מלאכותי:

מדיומים המכילים סרום

התוסף הנפוץ ביותר במדיום המשמש לגידול תאים של בעלי חיים הוא סרום עגלי. הוא מתווסף למדיום התרבית כתוסף זול על מנת להשיג את תנאי הגידול הטובים ביותר האפשריים. בנוסף לתפקידו כמוביל או כקושרי חומרים מזינים שאינם יציבים או שאינם מסיסים במים, הורמונים וגורמי גדילה, מעכבי פרוטאז וחומרים אחרים, הסרום גם קושר ומנטרל מולקולות מזיקות.

מדיום נטול סרום

לנוכחות סרום במדיום יש מספר חסרונות, והיא עלולה לגרום לטעויות פרשנות משמעותיות במחקר אימונולוגי [2, 3]. פותחו מגוון רחב של מדיומים נטולי סרום [4, 5]. מדיומים אלה מנוסחים בדרך כלל באופן ספציפי כדי לתמוך בגידול של סוג תא בודד, כגון Knockout Serum Replacement ו-Knockout DMEM מבית Thermo Fisher Scientific, ומדיום mTESR מבית Stem Cell Technologies [6], המיועד לתאי גזע [7].

בנוסף, מצעים אלה משלבים כמויות מוגדרות של גורמי גדילה מטוהרים, ליפופרוטאינים וחלבונים אחרים, אשר בדרך כלל מסופקים על ידי הסרום [8]. מצעים אלה מכונים לעתים קרובות "מצעי תרבית מוגדרים" (defined cultural media), שכן המרכיבים המרכיבים אותם מובנים היטב.

מדיומים מוגדרים כימית

מדיומים אלה כוללים רכיבים אנאורגניים ואורגניים טהורים במיוחד, שלא זוהמו בשום סוג של זיהום. הם עשויים לכלול גם תוספות של חלבונים טהורים, כגון גורמי גדילה.

 השינוי הגנטי של חיידקים או שמרים, יחד עם תוספת של חומצות שומן מסוימות, ויטמינים, כולסטרול וחומצות אמינו, מביא לייצור המרכיבים הללו [9].

מצעים נטולי חלבון

מדיה נטולת חלבונים היא מדיה שאינה מכילה חלבונים כלל, אלא רק מרכיבים שאינם חלבוניים. בהשוואה למדיה עם תוספת סרום, השימוש במדיה ללא תוספת חלבונים מעודד התרבות תאים מוגברת וביטוי חלבוני, ומקל על טיהור כל מוצר שנוצר בתהליך המשך [10-12]. חלבון אינו נכלל בתרכובות כגון MEM ו-RPMI-1640. עם זאת, ניתן להוסיף תוסף חלבון במידת הצורך.

מצעי גידול ומרכיביהם הבסיסיים

ניתן לרכוש מצע גידול מסחרי כאבקה או כנוזל, והוא כולל לעתים קרובות מגוון חומרים מזינים כגון חומצות אמינו, גלוקוז, מלחים, ויטמינים ותוספי תזונה אחרים. 

הצרכים במרכיבים אלה שונים עבור כל קו תאים, והשונות הזו היא הגורם למגוון הרחב של תרכובות התרבית השונות. כל מרכיב אחראי על פונקציה מסוימת, שתתואר בפסקאות הבאות:

מערכות חיץ

כדי לשמור על תנאי גידול מיטביים, יש לשלוט ב-pH, דבר הנעשה לרוב באמצעות אחת משתי מערכות חיץ:

מערכת חיץ טבעית

היחס בין CO₂ ל-H₂CO₃ באטמוספירה זהה לזה שבמדיום, מה שיוצר מנגנון חיץ טבעי. על מנת לשמר את מנגנון החיץ הטבעי, יש לשמור את התרבויות בסביבה אווירית עם 5-10% CO₂, דבר המושג לרוב באמצעות שימוש באינקובטור CO₂. אחד היתרונות הבולטים בשימוש במנגנון חיץ טבעי הוא העלות הנמוכה והבטיחות הגבוהה שלו.

HEPES

חיץ כימי המשתמש בזוויטריון HEPES בעל יכולת חיץ גבוהה יותר בטווח ה-pH של 7.2-7.4 ואינו מצריך סביבה גזית מבוקרת. עבור סוגי תאים מסוימים, מינון גבוה יותר של HEPES עלול להזיק. מדיה המכילה HEPES רגישה אף היא הרבה יותר להשפעות הפוטוטוקסיות של אור פלורסנטי [13].

פנול אדום

אינדיקטור ה-pH "פנול אדום" נכלל לעתים קרובות במדיום תרבית זמין מסחרית, ומאפשר ניטור רציף של ה-pH. עם התרבות התאים, המטבוליטים המופקים על ידם גורמים לשינוי ב-pH, וכתוצאה מכך לשינוי צבע המדיום. לפנול אדום יש השפעה כפולה על צבע המדיום: הוא הופך אותו לצהוב ב-pH חומצי ולסגול ב-pH בסיסי. pH 7.4, הערך האופטימלי לגידול תאים, גורם למדיום להיראות אדום זוהר.

אך לפנול אדום יש כמה חסרונות: ראשית, פנול אדום מסוגל לדמות את פעולתן של מספר הורמונים סטרואידים, בעיקר אסטרוגן [14]. לפיכך, בעת חקר תאים הרגישים לאסטרוגן, כגון רקמת השד, מומלץ להשתמש במצע נטול פנול אדום. נוכחותו של אדום פנול במספר פורמולות נטולות סרום משבשת את איזון הנתרן-אשלגן. הוספת סרום או הורמון יותרת המוח של בקר למדיום עשויה לנטרל השפעה זו [15]. שלישית, נוכחותו של אדום פנול מקשה על הזיהוי בניסויים של ציטומטריית זרימה.

מלחים אנאורגניים

מדיומים המכילים מלחים אנאורגניים, כגון יוני נתרן, אשלגן וסידן, מסייעים בשמירה על שיווי משקל אוסמוטי ובוויסות פוטנציאל הממברנה.

חומצות אמינו

מכיוון שחומצות אמינו הן המרכיבים הבסיסיים של החלבון, הן מהוות מרכיב חיוני בכל מצע גידול תאים שנוצר אי פעם. מכיוון שהתאים אינם מסוגלים לייצר חומצות אמינו מסוימות בכוחות עצמם, חשוב שמצע התרבית יכלול חומצות אמינו חיוניות. הן הכרחיות להתרבות התאים, והריכוז שבו הן נמצאות קובע את צפיפות התאים המרבית שניתן להשיג. בפרט, L-גלוטמין, חומצת אמינו חיונית, היא בעלת חשיבות מכרעת.

L-גלוטמין משמשת כמקור אנרגיה משני למטבוליזם ותורמת חנקן לייצור NAD, NADPH ונוקלאוטידים. מכיוון ש-L-גלוטמין היא חומצת אמינו לא יציבה, אשר עם הזמן הופכת לצורה שהתאים אינם מסוגלים לנצל, יש להוסיף אותה למדיום.

בנוסף, ניתן לספק למצע חומצות אמינו לא חיוניות על מנת לחדש את מלאי החומצות האמינו שנוצלו במהלך תהליך הגידול. הוספת חומצות אמינו לא חיוניות למצע הגידול מגבירה את קצב הגידול של התאים ומשפרת את כושר ההישרדות שלהם.

פחמימות

פחמימות בצורת סוכרים מהוות את מקור האנרגיה העיקרי. רבים מהמדיומים כוללים גם מלטוז ופרוקטוז, בנוסף לסוכרים הנפוצים יותר – גלוקוז וגלקטוז.

חלבונים ופפטידים

אלבומין, טרנספרין ופיברונקטין הם החלבונים והפפטידים הנפוצים ביותר. חשיבותם רבה במיוחד במדיומים שאינם מכילים סרום. אלבומין, טרנספרין, אפרותינין, פטואין ופיברונקטין הם חלק מהחלבונים העשויים להימצא בסרום, המהווה מקור עשיר לחלבון.

אלבומין הוא החלבון העיקרי הנמצא בדם, ותפקידו הוא לקשור ולהעביר חומרים שונים, כולל מים, מלחים, חומצות שומן חופשיות, הורמונים וויטמינים, בין איברים ותאים שונים. יכולתו של האלבומין להיקשר לחומרים כימיים הופכת אותו למועמד יעיל להסרת תרכובות מזיקות מהמדיום שבו מתורבתים התאים.

אפרוטינין הוא חומר מגן במערכות תרבית תאים, שכן הוא יציב ב-pH ניטרלי וחומצי, וכן עמיד בטמפרטורות גבוהות ובפני הרס שעלול להיגרם על ידי אנזימים פרוטאוליטיים. הוא מסוגל לעכב מספר פרוטאזות סרין, כולל טריפסין, בין היתר.

פטואין הוא גליקופרוטאין שניתן לאתר בכמויות גבוהות יותר בסרום של עוברים ושל בעלי חיים שזה עתה נולדו, בהשוואה לסרום של בוגרים. בנוסף לכך, הוא פועל כמעכב פרוטאז סרין. החלבון פיברונקטין הוא מרכיב חיוני בתהליך ההידבקות התאית. טרנספרין הוא חלבון המוביל ברזל ואחראי על העברתו לקרומי התאים.

חומצות שומן ושומנים

הם ממלאים תפקיד מכריע במדיום נטול סרום כאשר הסרום נעדר.

ויטמינים

ויטמינים רבים חיוניים להתפתחות התאים ולהתרבותם. התאים אינם מסוגלים לייצר ויטמינים בכמויות מספיקות, ולכן הם חיוניים בתרבית רקמות כתוספי תזונה.

בתרבית תאים, הסרום הוא המקור העיקרי לוויטמינים; עם זאת, התרבית מטופלת גם בוויטמינים שונים כדי להתאימה לסוג תאים ספציפי. בדרך כלל, ויטמינים מקבוצת B משמשים לגירוי הצמיחה.

יסודות קורט

יסודות כימיים כגון נחושת, אבץ, סלניום וחומרי ביניים של חומצה טריקרבוקסילית מכונים יסודות קורט. יסודות קורט מתווספים לעתים קרובות לתרבית שאינה כוללת סרום, על מנת להחליף את אלה הנמצאים בדרך כלל בסרום. יסודות אלה הם מרכיבים כימיים חשובים הנדרשים להתפתחות תאים בריאה. תגובות ביוכימיות רבות תלויות במיקרו-נוטריינטים מסוימים, כגון פעילות אנזימטית.

תוספי מצע

המדיום המלא המומלץ עבור קווי תאים מסוימים זקוק למרכיבים נוספים שאינם קיימים במדיום הבסיסי ובסרום. תוספים תזונתיים אלה תומכים בצמיחת התאים ובתפקוד מטבולי תקין.

למרות שהורמונים, גורמי גדילה ומולקולות איתות חיוניים לשגשוג תקין של קווי תאים מסוימים, יש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות הבאים: מכיוון שתוספת תוספים עלולה לשנות את האוסמולליות של מצע הגידול המלא, דבר שעלול לעכב את התפתחות התאים, מומלץ תמיד לאמת את האוסמולליות לאחר הוספת התוספים. עבור רוב קווי התאים, האוסמולליות האופטימלית נעה בין 260 ל-320 mOSM/kg.

אנטיביוטיקה

לעתים קרובות נעשה שימוש באנטיביוטיקה כדי לעכב התפתחות של מזהמים חיידקיים ופטרייתיים [16], אף על פי שהיא אינה חיונית לצמיחת התאים. מכיוון שאנטיביוטיקה עלולה להסוות זיהום על ידי מיקופלסמה וחיידקים עמידים, לא מומלץ להשתמש בה באופן שגרתי בתרבית תאים [17, 18].

בנוסף, אנטיביוטיקה עלולה לשבש את חילוף החומרים של תאים רגישים במיוחד. לעתים קרובות נעשה שימוש בתערובות של פניצילין וסטרופטומיצין המיוצרות על ידי MilliporeSigma ו-Life Technologies. Plasmocin שימש בתרבית קווי התאים של גליומה TS603, TS516 ו-BT260 [19], והוכח כיעיל בהסרת זיהום במיקופלסמה (20).

סרום

בסרום קיימים אלבומינים, גורמי גדילה ומעכבי גדילה. הסרום הוא אחד המרכיבים החשובים ביותר במדיום לגידול תאים, שכן הוא מספק חומצות אמינו, חלבונים, ויטמינים (במיוחד ויטמינים מסיסים בשומן כגון A, D, E ו-K), פחמימות, ליפידים, הורמונים, גורמי גדילה, מינרלים ויסודות קורט.

סרום שמקורו בעוברים ובעגלים משמש לעתים קרובות לקידום התפתחותם של תאים מתורבתים. סרום עוברי מהווה מקור עשיר לגורמי גדילה, והוא מתאים לשכפול תאים ולפיתוח תאים רגישים. בשל יכולותיו המופחתות לקידום גדילה, סרום עגלים משמש בניסויי עיכוב מגע. מצעי גידול רגילים כוללים לרוב 2% עד 10% סרום. הוספת סרום למצע התרבית משרתת את המטרות הבאות [21]:

• הסרום מספק את החומרים המזינים החיוניים לתאים (הן בתמיסה והן קשורים לחלבונים).

• בסרום כלולים מספר גורמי גדילה והורמונים המעורבים בקידום הגדילה ובפעילות תאים מיוחדת.

• הוא מספק חלבוני קישור רבים, כגון אלבומין וטרנספרין, המעבירים חומרים כימיים אחרים לתוך התא. לדוגמה, אלבומין מעביר שומנים, ויטמינים, הורמונים וכדומה לתוך התאים.

• הוא מספק גם חלבונים, כגון פיברונקטין, המגבירים את הידבקות התאים למצע. בנוסף, הוא מייצר גורמים המסייעים להתפשטות התאים לפני החלוקה.

• הוא מספק מעכבי פרוטאז המונעים פירוק חלבונים בתאים.

• הוא מכיל גם מינרלים כגון Na+, K+, Zn2+ ו-Fe2+.

• הוא משפר את צמיגות המדיום, ובכך מגן על התאים מפני פגיעה מכנית במהלך ערבוב בתרבית תאים בתמיסה.

• הוא משמש גם כמאגר.

מקורות

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. תזונה של תאים מן החי בתרבית רקמה; מחקרים ראשוניים על מצע סינתטי. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. ספיחה מהירה של מרכיב בסרום עגל עוברי על ידי תאי יונקים בתרבית. מקור פוטנציאלי לתופעות מלאכותיות במחקרים על נוגדנים לאנטיגנים ספציפיים לתאים. Immunology. 1976;31:881-91

[3] סולה ק', דראבר פ', נוזה ק'. הוספת סרום למדיום המשמש להכנת תמיסות תאים כמקור אפשרי לתוצאות מלאכותיות בתגובות מתווכות-תאים שנחקרו באמצעות מבחן בלוטת הלימפה הפופליטלית. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. מצעים מסחריים נטולי סרום: גידול היברידומות וייצור נוגדנים מונוקלונליים. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. שיטות לגידול תאים מתורבתים במדיום נטול סרום. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. חלבוני HSP70 מלווים את ה-TDP-43 נטול ה-RNA אל תוך מעטפות נוזליות כדוריות אנאיזוטרופיות בתוך הגרעין. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. הזדקנות המושרית על ידי תסמונת דאון משבשת את הארכיטקטורה הגרעינית של תאי אב עצביים. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. החלפה מלאה של סרום באלבומין, טרנספרין ושומני סויה בתרבויות של לימפוציטים מסוג B המגיבים לליפופוליסכריד. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. שיפור שיטתי של מצע נטול חלבונים המוגדר כימית לגידול היברידומות וייצור נוגדנים מונוקלונליים. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. מצע נטול חלבונים לגידול היברידומות ותאים אחרים של מערכת החיסון. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. תרבית תאים נטולת סרום: גישה מאחדת. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. גידול קלונלי של קווי תאים של אוגר סיני במדיום נטול חלבונים. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. ניתוח ההשפעות הציטוטוקסיות של מצע תרבית המכיל HEPES שנחשף לאור. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. פנול אדום במדיום לגידול רקמות הוא אסטרוגן חלש: השלכות על המחקר של תאים המגיבים לאסטרוגן בתרבית. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. פיתוח מצעים נטולי סרום. בתוך: Master JRW, עורך. Animal Cell culture, מהדורה שלישית. אוקספורד: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. שימוש באנטיביוטיקה במדיום לגידול תאים. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. התפשטות ובקרה של זיהום במיקופלסמה בתרבויות תאים. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] מאסטרס ג', סטייסי ג'. החלפת מצע וריבוי קווי תאים. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. דמתילאז ההיסטון KDM6A מזהה באופן ישיר חמצן כדי לשלוט בכרומטין ובגורל התא. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. יעילות Plasmocin™ על קווי תאים שונים של יונקים הנגועים במוליקוטים בהשוואה לאנטיביוטיקות נפוצות בתרבית תאים: ניסיון מקומי. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. היבטים מולקולריים של קישור ליגנד לאלבומין בסרום. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53