תאים ראשוניים אנושיים

מהן תאים ראשוניים אנושיים?

תאים ראשוניים הם הייצוג הטהור ביותר של הרקמות מהן הם נלקחו. הם מבודדים מהרקמה ועוברים עיבוד כדי שיוכלו להיקלט בתנאי תרבית אידיאליים. הם מדמים בצורה מדויקת יותר את המצב in vivo ומפגינים פיזיולוגיה תקינה, מכיוון שהם נגזרים מרקמה ולא עברו שינויים. בשל כך, הם יכולים לשמש כמודלים שימושיים למחקר בתחומי הפרמקולוגיה התאית, הטוקסיקולוגיה והפיזיולוגיה (כולל מחקרים על חילוף חומרים, הזדקנות והעברת אותות). יש לזכור שתאי גזע ראשוניים קשים יותר לגידול ולתחזוקה מאשר קו תאים רציף, מכיוון שתוחלת החיים שלהם קצרה יותר והם יפסיקו להתחלק (או יזדקנו) לאחר מספר מסוים של חלוקות תאים. מחקרים על מסלולי איתות תאיים מסתבכים בשל השונות המובנית של תאים ראשוניים הנרכשים מתורמים וכתוצאה מתהליכי תרבית משנה. לפני תחילת מחקרי האיתות, חוקרים מבצעים לעתים קרובות סינון כדי לקבוע אם התאים מגיבים לגירויים נפוצים. כדי להימנע מבזבוז זמן וכסף, ניתן לעורר תאים ראשוניים להפעיל מסלולי איתות עיקריים לפני הסינון.

מדוע להשתמש בתאים ראשוניים אנושיים?

קווי תאים מהונדסים משמשים בדרך כלל כבדיקת תאים. עם זאת, מדענים הכירו בכך ששינויים ביולוגיים הנובעים מקווי תאים עלולים לפגוע בחקר המשמעות הפיזיולוגית שלהם. השימוש בתאים ראשוניים אנושיים משפר את הערך הפיזיולוגי של הנתונים המתקבלים באמצעות תרבויות תאים, והם נחשבים יותר ויותר כבעלי חשיבות לחקר תהליכים ביולוגיים, התקדמות מחלות ופיתוח תרופות.

תאים ראשוניים אנושיים נמצאים בשימוש נרחב במחקרים במבחנה העוסקים בתקשורת בין-תאית ובתוך-תאית, בביולוגיה התפתחותית ובמנגנונים העומדים בבסיס סרטן, מחלת פרקינסון וסוכרת, בין תחומי מחקר ביולוגיים פרה-קליניים ומחקריים רבים אחרים. חוקרים משתמשים זה מכבר בקווי תאים שהפכו לבלתי-מתים כדי לחקור את תפקוד הרקמות; עם זאת, קווי תאים עם מוטציות ברורות וחריגות כרומוזומליות עשויים שלא להוות תחליף הולם לתאים נורמליים ולהתפתחות המחלה בשלבים המוקדמים שלה. כיום ניתן להשיג מודל מדויק יותר של סוג תא רקמה ספציפי באמצעות תאים ראשוניים אנושיים המבודדים מאותה רקמה ומוחזקים במדיום תרבית תאים ראשוניים ובתוספים.

מהי תרבית תאים ראשוניים?

במקום להשתמש בקווי תאים בלתי-מתים, תרבית תאים ראשוניים כרוכה בגידול תאים ישירות מאורגניזם רב-תאי מחוץ לגוף. במדינות מסוימות, כגון בריטניה, קיימת הכרה חוקית בעובדה שתרבית תאים ראשוניים מייצגת טוב יותר רקמות in vivo מאשר קווי תאים. עם זאת, תאים ראשוניים זקוקים למצע ולחומרים מזינים מתאימים כדי לגדול, ולאחר מספר חלוקות מסוים, הם מפתחים פנוטיפ מזדקן הגורם להם להפסיק להתחלק לצמיתות. שני גורמים אלה מהווים את המניע ליצירת קווי תאים. ניתן לגדל בתרבית תאים הן תאים ראשוניים שהפכו לבלתי-מותיים באופן טבעי (למשל, תאי HeLa) והן תאים ראשוניים שהפכו לבלתי-מותיים באופן מלאכותי (למשל, תאי HEK) ללא הגבלת זמן.

תאים ראשוניים אנושיים לפי סוגי רקמות

תאי אפיתל, פיברובלסטים, קרטינוציטים, מלנוציטים, תאי אנדותל, תאי שריר, תאי חיסון ותאי גזע כגון תאי גזע מזנכימליים נמנים עם תאי הגזע הראשוניים האנושיים הנפוצים ביותר במחקר מדעי. ראשית, התרבויות הן הטרוגניות (מייצגות תערובת של סוגי תאים הקיימים ברקמה), וניתן לשמור על חייהן במבחנה רק למשך פרק זמן מוגדר. טרנספורמציה היא תהליך במבחנה המאפשר מניפולציה של תאים ראשוניים אנושיים לצורך יצירת תרבויות משנה ללא הגבלה. הטרנספורמציה יכולה להתרחש באופן טבעי, או להיות מושרה על ידי חומרים כימיים או נגיפים. לאחר שעברה טרנספורמציה גנטית, תרבית ראשונית יכולה להתחלק ללא הגבלה לקו תאים משני שהפך לבלתי-מותי, אם תקבל מספיק חומרים מזינים ומרחב.

תאי אנדותל

טיפול בסרטן, ריפוי פצעים, מחקר בתחום איתות תאי, סינון בתפוקה גבוהה ובתוכן גבוה, וסינון טוקסיקולוגי הם רק חלק מהתחומים שיכולים להפיק תועלת מהשימוש בתאי אנדותל ראשוניים ככלי מחקר.

קרטינוציטים

קרטינוציטים, המופקים מהאפידרמיס של עור אנושי בוגר או מעורלה של תינוק, ממלאים תפקיד מכריע בחקר מחלות עור כגון פסוריאזיס וסרטן.

תאי אפיתל

ממחקרי סרטן ועד לחקירות טוקסיקולוגיות, תאי אפיתל ראשוניים הוכחו כמשאבים בעלי ערך רב למודלים של מנגנוני ההגנה הטבעיים של הגוף.

פיברובלסטים

הפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) וחקר ריפוי פצעים הם רק חלק מהשימושים הרבים של פיברובלסטים ראשוניים.

תאי חיסון

תאי דם מונונוקלאריים היקפיים, או PBMC בקיצור, הם תאי דם בעלי גרעין עגול. הם כוללים בעיקר לימפוציטים ומונוציטים, הממלאים תפקידים חשובים במהלך התגובה החיסונית. תאי דם היקפיים חד-גרעיניים משמשים לעתים קרובות לאבחון זיהומים או לזיהוי הגנה אפשרית מפני חיסונים. הבנה מעמיקה של התגובה החיסונית התאית המתווכת על ידי תאי T היא לעתים קרובות חיונית.

מלנוציטים

מלנוציטים, תאי העור המיוחדים המייצרים את הפיגמנט מלנין, משמשים כמודלים מועילים למחקר בנושאים כגון ריפוי פצעים, רעילות, מלנומה, התגובה העורית לקרינת אולטרה סגולה (UV), מחלות עור וקוסמטיקה.

תאי גזע

לתאי גזע יש פוטנציאל להתמיין למגוון רחב של סוגי תאים. בזכות יכולת ההתמיינות שלהם, הם מספקים הזדמנויות חדשות ליצירת מודלים של רקמות אנושיות ומצבים בריאותיים.

תאי גזע מזנכימליים

תאי גזע מזנכימליים, הידועים גם כ-MSCs, ניתן להפיק ממקורות אנושיים שונים כגון מח עצם, שומן (רקמת שומן), רקמת חבל הטבור (ג'לי וורטון) ונוזל מי השפיר (הנוזל המקיף את העובר), וניתן להרבותם במבחנה. לתאי גזע סטרומליים בוגרים אלה יש את היכולת להתפתח למגוון רחב של סוגי תאים. חלק מסוגי התאים הללו כוללים תאי עצם, תאי סחוס, תאי שריר, תאי עצב, תאי עור ותאי קרנית.

תאי שריר חלק

בתוך איברים חלולים, תאי שריר חלק ראשוניים (SMCs) מצפים את החלק הפנימי ומתווכים את יכולת ההתכווצות. בנוסף לסרטן ולמחלות אחרות, ניתן להשתמש ב-SMCs ליצירת מודל של פיברוזיס כתוצאה מיתר לחץ דם.

תאים ראשוניים וקווי תאים

בין אם באמצעות מוטציה ספונטנית, כמו בקווי תאים סרטניים שעברו טרנספורמציה, ובין אם באמצעות שינוי מכוון, כמו בייצור מלאכותי של גנים סרטניים, קווי תאים רציפים זכו ביכולת להתרבות ללא סוף (הפכו לבלתי-מותיים). ככלל, קווי תאים רציפים הם אמינים ונוחים יותר לעבודה מאשר תאים ראשוניים. הם יכולים להתרבות ללא הגבלה ולספק גישה מהירה לנתונים חיוניים. לשימוש בקווי תאים רציפים יש מגבלות מסוימות, כולל העובדה שהם מהונדסים גנטית/מומרים, מה שעלול לשנות את המאפיינים הפיזיולוגיים ולא להתאים לתנאים in vivo, וכן שהדבר עלול להשתנות עוד יותר עם הזמן בעקבות מעברי תרבית רבים.

התקדמות בתרבית תאים ראשוניים

לתאים ראשוניים יש מוניטין ידוע לשמצה כקשים לעבודה. עם זאת, התהליך הופך לקל יותר מאי פעם הודות להתפתחויות בתרבית תאים ראשוניים, לזמינותם של תאים ראשוניים מסחריים עם פרוטוקולים מותאמים באופן מלא, ולטכניקות ניתוח חדשות הדורשות פחות מאמץ.

המעבר מתרבית תאים דו-ממדית לתלת-ממדית נחשב לאבן דרך משמעותית בתחום. הארכיטקטורה הספציפית לרקמה, האינטראקציות בין תאים, והאותות המכניים/ביוכימיים עלולים להיות מוחלשים בתרבית דו-ממדית. לפיכך, קיים גבול לערך הביולוגי של תרבויות אלו.

מצד שני, תרבית תאים תלת-ממדית מאפשרת לתאים להתרחב ולתקשר עם מבנה חוץ-תאי תלת-ממדי. הדבר מאפשר לתאים לקיים אינטראקציה זה עם זה ועם המטריצה החוץ-תאית, מה שהופך את התרבויות התלת-ממדיות לרלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית. הדיוק של שיטה זו בחיזוי תגובות in vivo הפך אותה למהפכנית בתחומים כגון גילוי ופיתוח תרופות. בשל כך, טכנולוגיות מתקדמות, כגון אורגנואידים שמקורם בחולים ו"איברים על שבב", מספקות מודלים בעלי הקשר גבוה לסינון ופיתוח תרופות.

יצירת תאים ראשוניים מהווה צוואר בקבוק בתרבית ראשונית. בדרך כלל נדרש נפח רקמה גדול יותר כדי להתגבר על כך, דבר שעשוי להיות מאתגר להשגה. עם זאת, רגישות אנליטית משופרת מספקת דרך קדימה. לדוגמה, הצורך בגידול כמויות גדולות של תאים ראשוניים מצטמצם באמצעות טכנולוגיית תא בודד, הכוללת ריצוף, ווסטרן בלוטינג וציטומטריית מסה.

אופקים מבטיחים לתרבית תאים ראשוניים

הקשיים הכלליים הכרוכים בתרבית תאים ראשוניים מתמתנים הודות להתקדמות הטכנולוגית. בתמורה, שיטה זו מחליפה במהירות שיטות אחרות כסטנדרט הזהב במחקר ובפרקטיקה של הביולוגיה התאית והמולקולרית. ייצור חיסונים, השתלת איברים, טיפולים בתאי גזע, מחקר הסרטן ועוד תחומים רבים צפויים להפיק תועלת רבה מההתקדמות המתמשכת בתרבית תאים ראשוניים.

טיפים וטריקים לגידול תאים ראשוניים

הצרכים של התרבות התאים

שתי השיטות הנפוצות ביותר לגידול תאים ראשוניים הן בתמיסה או על משטח (דו-ממדי). תאים מסוימים מסוגלים לצוף בחופשיות בזרם הדם מבלי להיצמד למשטח כלל (למשל, תאים שמקורם בדם היקפי). קווי תאים שונים הונדסו כך שיוכלו לשגשג בתרבויות בתמיסה, שם הם יכולים להגיע לצפיפות שאינה ניתנת להשגה בתנאי גידול דו-ממדיים. תאים ראשוניים הזקוקים לעיגון כדי לגדול במבחנה נקראים תאים דבקים וכוללים את אלה הנמצאים ברקמות מוצקות. כדי לשפר את תכונות ההיצמדות ולספק אותות נוספים הנדרשים לצמיחה ולהתמיינות, תאים אלה מתורבתים בדרך כלל בכלי פלסטיק שטוח ללא ציפוי, אך לעיתים גם על גבי מיקרו-נשא. האפשרות האחרונה עשויה להיות מצופה בחלבוני מטריצה חוץ-תאית (כגון קולגן ולמינין). המדיום המשמש בתרבית תאים מורכב ממדיום בסיסי שהועשר בגורמי גדילה ובציטוקינים המתאימים. אינקובטור תאים הוא סוג מיוחד של אינקובטור מעבדה המשמש לגידול ולתחזוקת תאים בטמפרטורה ותערובת גזים ספציפיות (בדרך כלל 37 °C, 5% CO₂ לתאי יונקים). התנאים האופטימליים עשויים להשתנות מאוד בהתאם לסוג התא המגודר. בהתאם לסוגי התאים המגודרים, המדיום האופטימלי יכיל שילוב ייחודי של גורמים, הכוללים, בין היתר, את רמת ה-pH, ריכוז הגלוקוז, גורמי גדילה ונוכחות חומרים מזינים נוספים.

נוכחות אנטיביוטיקה במדיום הגידול היא חיונית במהלך הקמת התרבית הראשונית כדי למנוע זיהום מרקמת המארח. חלק ממשטרי הטיפול האנטיביוטיים כוללים שילוב של גנטמיצין, פניצילין, סטרפטומיצין ואמפותריצין B. עם זאת, לא מומלץ להשתמש באנטיביוטיקה לתקופה ממושכת, מכיוון שחלק מהחומרים (כגון אמפותריצין B) עלולים להיות רעילים לתאים בטווח הארוך.

רוב התאים הראשוניים עוברים תהליך הזדקנות ומפסיקים להתחלק לאחר מספר מסוים של הכפלות אוכלוסייה, ולכן חיוני לשמור על חיוניותם לאחר הבידוד. כדי להבטיח את חיוניות התאים לאורך זמן נדרשות טכניקות מתוחכמות לגידול תאים ותנאי גידול אידיאליים (כולל המדיום הנכון, הטמפרטורה הנכונה, תערובת הגזים הנכונה, רמת ה-pH הנכונה, הריכוז הנכון של גורמי הגדילה, נוכחות חומרים מזינים ונוכחות גלוקוז). מכיוון שרבים מגורמי הגדילה המשמשים להשלמת התמיסות מופקים מדם של בעלי חיים (למרכיבים שמקורם בדם פוטנציאל לזיהום), מומלץ לצמצם את השימוש בהם למינימום או להימנע ממנו לחלוטין. כמו כן, חשוב להשתמש בטכניקה ספטית.

תת-תרבית ותחזוקה

כאשר תאים מבודדים נדבקים למשטח צלחת התרבית, הדבר מסמן את תחילת שלב התחזוקה. ההיצמדות מתרחשת בדרך כלל 24 שעות לאחר תחילת התרבית. יש לבצע תרבית משנה כאשר התאים הגיעו לאחוז צפיפות מסוים והם מתרבים באופן פעיל. מכיוון שתאים לאחר צפיפות מלאה עלולים לעבור התמיינות ולהפגין התרבות איטית יותר לאחר המעבר, עדיף לבצע תרבית משנה של תרבויות תאים ראשוניות לפני שהן מגיעות לצפיפות של 100%.

התרבות משנית במדיום טרי שומרת על הצמיחה האקספוננציאלית של תאים התלויים בהיצמדות. תרבות משנית של שכבות חד-תאיות משבשת את האינטראקציות הבין-תאיות ובתוך-התאיות על פני השטח של התאים. ריכוזים נמוכים של אנזימים פרוטאוליטיים, כגון טריפסין/EDTA, משמשים להפקת תאים ראשוניים דבקים משכבות חד-תאיות או מרקמות. לאחר פירוקם ודילולם לתמיסה של תאים בודדים, התאים נספרים ומועברים למכלי תרבית טריים כדי להיקשר מחדש ולהתרבות.

שימור בקריו והחזרה

שימור בקריוגניקה משמר תאים חיים על ידי הקפאתם בטמפרטורות נמוכות. שימור בקריוגניקה והפשרה של תאים ראשוניים אנושיים מונעים מוות ונזק לתאים במהלך האחסון והשימוש. תאים ראשוניים אנושיים עוברים הגנה קריוגנית באמצעות DMSO או גליצרול (בטמפרטורה הנכונה ובקצב הקפאה מבוקר). תהליך ההקפאה חייב להיות הדרגתי, בקצב של -1 °C בכל דקה, כדי למנוע היווצרות גבישי קרח. אחסון לטווח ארוך מחייב שימוש בחנקן נוזלי (-196 °C) או בטמפרטורות הנמוכות מ-130 °C.

כל שנדרש להפשרת תאים שעברו שימור בקריוגניקה הוא טבילת התאים הקפואים באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך כ-1 עד 2 דקות. אין לבצע צנטריפוגה של תאים ראשוניים אנושיים לאחר הוצאתם מהמקפיא (מכיוון שהם רגישים ביותר לנזק במהלך ההתאוששות משימור בקריוגניקה). ניתן לצלחת את התאים מיד לאחר ההפשרה, והדבר מעודד היצמדות בתרבויות במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הצלחת. 1 לאחר שהתאים הראשוניים שהוקפאו בהקפאה קריוגנית נצמדו, יש להסיר את התמיסה המשומשת (מכיוון ש-DMSO מזיק לתאים ראשוניים ועלול לגרום לירידה בכושר ההישרדות לאחר ההפשרה).