פורסם: 2023 | נבדק לאחרונה: מאי 2026
מדריך מקיף להקפאת תאים: הבטחת חיוניות וסטריליות
הקפאת תאים היא תהליך קריטי בניהול תרבית תאים, המבטיח אחסון ושימור לטווח ארוך של קווי תאים יקרי ערך. בין אם עובדים עם תאים אנושיים או תאים של בעלי חיים, הקפדה על פרוטוקולים מדויקים ושימוש בטכניקות ספטיות קפדניות הם תנאים הכרחיים להצלחת שימור בקירור.
מדריך זה מספק הוראות מפורטות לגבי החומרים והריאגנטים הדרושים, וכן נהלים שלב אחר שלב להקפאת תאים ביעילות תוך שמירה על חיוניותם וסטריליותם. על ידי הקפדה על הנחיות אלה, חוקרים יכולים לאחסן בביטחון תרבויות תאים ולהחיותן מאוחר יותר עם אובדן מינימלי בחיוניות התאים, תוך שמירה על שלמות ואמינות תוצאות הניסויים שלהם.
כדי להתחיל, חיוני ליצור סביבת עבודה סטרילית. טכניקות סטריליות נכונות ממלאות תפקיד מכריע במניעת זיהום ובהבטחת סטריליות התרבויות.
טכניקה אספטית
יש להקפיד על טכניקות סטריליות לאורך כל התהליך כדי להבטיח את סטריליות התרבויות.
תהליך הקפאת תאים מקיף
תרשים זרימה זה מספק מדריך חזותי מפורט לשלבים החיוניים בהקפאה נכונה של תאים. יש לעקוב אחר נהלים אלה כדי להבטיח חיוניות ותקינות גבוהות של התאים במהלך תהליך השימור בקירור.
הכנת מדיום הקפאה
הכינו מדיום הקפאה קריוגני בהתאם לסוג התאים:
- תרבויות במדיום המכיל FBS: 90% FBS + 10% DMSO או 70% מדיום גידול, 20% FBS ו-10% DMSO
- תאים הדורשים גליצרול: 90% FBS + 10% גליצרול
שקלו לרכוש את מדיום ההקפאה המוכן שלנו:
- חומר הקפאה CM-1: לפרוטוקולים הדורשים חומר המכיל סרום עגלי (FBS)
- מדיום הקפאה CM-ACF - ללא סרום: כחלופה ללא FBS
תיוג ותיעוד
יש לתייג את מבחנות הקריו עם הפרטים הבאים:
- תאריך
- שם החוקר
- מספר התאים
- מספר מעבר
- סוג התא
- מידע נוסף (למשל, שינויים גנטיים)
הכנת התאים
לתאים דבקים:
- יש לעקוב אחר התאים עד שהם מגיעים ל-85–95% צפיפות
- יש לשאוב את מצע התרבית הישן
- יש לשטוף את שכבת התאים החד-שכבתית ב-PBS נטול סידן ומגנזיום
- הפרידו את התאים בעזרת Accutase, טריפסין או טריפסין-EDTA, ובמידת הצורך, נטרלו אותם באמצעות מצע גידול
- העבירו את תמיסת התאים למבחנת פלקון בנפח 50 מ"ל
לתאי תמיסה:
- בדוק את צפיפות התאים ואת מצבם הבריאותי תחת מיקרוסקופ
- העבר את תמיסת התאים ישירות למבחנת פלקון בנפח 50 מ"ל
ספירת תאים וצנטריפוגה
- ספרו את התאים באמצעות המטוסומטר או מונה תאים אוטומטי
- צנטריפוגו ב-300g למשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד את התאים
- יש לשאוב את הנוזל העליון בזהירות, תוך הימנעות מהפרעה למשקע התאים
- חמם את חומר ההקפאה המוכן ל-37°C לפני השימוש
שימור בקירור
- יש להמיס את משקע התאים במדיום ההקפאה לצפיפות של 2.0 מיליון תאים/מ"ל עבור תאים דבקים, ו-5 מיליון תאים/מ"ל עבור תאי תמיסה, או לריכוז הרצוי
- יש למזוג 1.0 מ"ל (או יותר לפי הצורך) מתמיסת התאים למבחנות הקפאה מסומנות
- יש להשתמש בשיטת הקפאה איטית לפני העברת התאים לאחסון לטווח ארוך
- ? שיטה
- ? שלבים
-
❄️
הקפאה ידנית -
1️⃣ הכניסו את התאים במדיום הקפאה למקפיא בטמפרטורה של 4°C למשך 40 דקות.
2️⃣ העבירו למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות.
3️⃣ אחסנו את התאים בחנקן נוזלי לשמירה לטווח ארוך. -
?
שימוש ב-Mr. Frosty -
1️⃣ הכינו את התאים במבחנות קריו עם חומר הקפאה.
2️⃣ הכניסו את מבחנות הקריו למיכל Mr. Frosty.
3️⃣ אחסנו בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות לפני העברה לחנקן נוזלי. -
?
מקפיא בקצב מבוקר -
1️⃣ תכנתו את המכשיר להורדת הטמפרטורה בהדרגה.
2️⃣ הכניסו את התאים המוכנים למקפיא.
3️⃣ לאחר מחזור ההקפאה, העבירו את התאים לחנקן נוזלי.
- אחסן את מבחנות הקריוגניות בטמפרטורות הנמוכות מ-130°C- או בחנקן נוזלי לשמירה לטווח ארוך.
חומרים וריאגנטים
- מבחנות קריוגניות בנפח 1–2 מ"ל
- יחידת הקפאה CoolCell® או מקפיא בקצב מבוקר
- מדיום הקפאה קריוגני (למשל, מדיום קריוגני DIY, CM-1, CM-ACF או מדיום ייעודי)
- סרום עגלי (FBS) או מדיום מותאם
- DMSO או גליצרול
- PBS ללא סידן ומגנזיום
- Accutase, טריפסין או טריפסין-EDTA (לתאים דבקים)
- מבחנות פלקון בנפח 15 מ"ל או 50 מ"ל
- המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי
- צנטריפוגה