เผยแพร่: 2023 | ทบทวนล่าสุด: พฤษภาคม 2026
คู่มือฉบับสมบูรณ์สำหรับการแช่แข็งเซลล์: การรักษาความมีชีวิตและความปลอดเชื้อ
การแช่แข็งเซลล์เป็นกระบวนการสำคัญในการจัดการการเพาะเลี้ยงเซลล์ เพื่อให้มั่นใจในการเก็บรักษาและอนุรักษ์สายพันธุ์เซลล์ที่มีคุณค่าในระยะยาว ไม่ว่าจะทำงานกับเซลล์มนุษย์หรือสัตว์ การปฏิบัติตามขั้นตอนอย่างเคร่งครัดและการรักษาเทคนิคปลอดเชื้ออย่างเข้มงวดเป็นสิ่งสำคัญยิ่งในการประสบความสำเร็จในการแช่แข็งเซลล์
คู่มือฉบับนี้ให้คำแนะนำอย่างละเอียดเกี่ยวกับวัสดุที่จำเป็น, สารเคมี, และขั้นตอนการดำเนินการทีละขั้นตอนเพื่อทำการแช่แข็งเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพ โดยรักษาความมีชีวิตและความสะอาดของเซลล์ไว้ได้ ด้วยการปฏิบัติตามคำแนะนำเหล่านี้ นักวิจัยสามารถเก็บรักษาและฟื้นฟูเซลล์เพาะเลี้ยงได้ในภายหลังอย่างมีประสิทธิภาพ โดยมีการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์น้อยที่สุด ซึ่งช่วยให้ความสมบูรณ์และความน่าเชื่อถือของผลการทดลองได้รับการรักษาไว้
ในการเริ่มต้น สิ่งสำคัญคือต้องสร้างสภาพแวดล้อมการทำงานที่ปราศจากเชื้อ เทคนิคการปลอดเชื้อที่เหมาะสมมีบทบาทสำคัญในการป้องกันการปนเปื้อนและรับรองความปลอดเชื้อของวัฒนธรรม
เทคนิคปลอดเชื้อ
ปฏิบัติตามเทคนิคปลอดเชื้อตลอดกระบวนการเพื่อให้แน่ใจว่าความบริสุทธิ์ของเชื้อไม่ถูกทำลาย
กระบวนการแช่แข็งเซลล์แบบครบวงจร
แผนผังนี้ให้คำแนะนำแบบละเอียดในรูปแบบภาพสำหรับขั้นตอนสำคัญที่เกี่ยวข้องกับการแช่แข็งเซลล์อย่างถูกต้อง ปฏิบัติตามขั้นตอนเหล่านี้เพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์มีความมีชีวิตและความสมบูรณ์สูงในระหว่างกระบวนการแช่แข็ง
การเตรียมสารละลายแช่แข็ง
เตรียมสารละลายป้องกันการแช่แข็งตามชนิดของเซลล์:
- อาหารเลี้ยงเชื้อที่มี FBS: 90% FBS + 10% DMSO หรือ 70% สื่อการเจริญเติบโต, 20% FBS และ 10% DMSO
- เซลล์ที่ต้องการกลีเซอรอล: 90% FBS + 10% กลีเซอรอล
โปรดพิจารณาการซื้อสื่ออาหารแช่แข็งที่เตรียมไว้ล่วงหน้าของเรา:
- น้ำยาเพาะเลี้ยงเซลล์แช่แข็ง CM-1: สำหรับโปรโตคอลที่ต้องการน้ำยาที่มีเซรั่มจากเลือดวัวในครรภ์ (FBS)
- น้ำยาแช่แข็ง CM-ACF - ปราศจากซีรัม: สำหรับทางเลือกที่ปราศจาก FBS
การติดฉลากและการจัดทำเอกสาร
ติดฉลากขวดแช่แข็งด้วยรายละเอียดดังต่อไปนี้:
- วันที่
- ชื่อนักวิจัย
- หมายเลขโทรศัพท์มือถือ
- หมายเลขทางเดิน
- ชนิดของเซลล์
- ข้อมูลเพิ่มเติมใด ๆ (เช่น การดัดแปลงทางพันธุกรรม)
การเตรียมเซลล์
สำหรับเซลล์ที่เกาะติด:
- ตรวจสอบเซลล์จนกว่าจะถึงระดับความหนาแน่น 85–95%
- ดูดสกัดอาหารเลี้ยงเชื้อเก่า
- ล้างเซลล์โมโนเลเยอร์ด้วย PBS ที่ปราศจากแคลเซียมและแมกนีเซียม
- แยกเซลล์ด้วย Accutase, trypsin หรือ trypsin-EDTA และทำให้เป็นกลางด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อหากจำเป็น
- ถ่ายโอนสารแขวนลอยเซลล์ลงในหลอดฟอลคอนขนาด 50 มิลลิลิตร
สำหรับเซลล์แขวนลอย:
- ตรวจสอบความหนาแน่นและสุขภาพของเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์
- ถ่ายโอนสารแขวนลอยเซลล์โดยตรงลงในหลอดฟอลคอนขนาด 50 มิลลิลิตร
การนับเซลล์และการปั่นเหวี่ยง
- นับจำนวนเซลล์โดยใช้กล้องนับเม็ดเลือดหรือเครื่องนับเซลล์อัตโนมัติ
- ปั่นเหวี่ยงที่ 300g เป็นเวลา 3-5 นาที ที่อุณหภูมิห้องเพื่อให้เซลล์ตกตะกอน
- ดูดของเหลวใสที่อยู่ด้านบนอย่างระมัดระวัง โดยหลีกเลี่ยงการรบกวนตะกอนเซลล์
- อุ่นสื่อการแช่แข็งที่เตรียมไว้ให้ถึง 37°C ก่อนใช้งาน
การแช่แข็งเพื่อการเก็บรักษา
- ละลายก้อนเซลล์ในสื่อการแช่แข็งให้มีความหนาแน่น 2.0 ล้านเซลล์/มิลลิลิตร สำหรับเซลล์ที่เกาะติด และ 5 ล้านเซลล์/มิลลิลิตร สำหรับเซลล์แขวนลอย หรือความเข้มข้นที่คุณต้องการ
- แบ่งตัวอย่าง 1.0 มิลลิลิตร (หรือมากกว่าตามต้องการ) ของสารแขวนลอยเซลล์ลงในหลอดแช่แข็งที่ติดฉลากเรียบร้อยแล้ว
- ใช้วิธีแช่แข็งแบบช้าๆ ก่อนที่จะถ่ายโอนเซลล์ไปยังการเก็บรักษาในระยะยาว
- ? วิธีการ
- ? ขั้นตอน
-
❄️
การแช่แข็งด้วยมือ -
1️⃣ นำเซลล์ไปไว้ในน้ำยาแช่แข็งในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 40 นาที
2️⃣ นำเซลล์ไปไว้ในตู้แช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง 3
️⃣ เก็บเซลล์ไว้ในไนโตรเจนเหลวเพื่อการเก็บรักษาในระยะยาว -
?
การใช้คุณฟรอสตี้ -
1️⃣ เตรียมเซลล์ในหลอดแช่แข็งด้วยสารละลายแช่แข็ง
2️⃣ วางหลอดแช่แข็งในภาชนะ Mr.
Frosty 3️⃣ เก็บไว้ที่ -80°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนย้ายไปยังไนโตรเจนเหลว -
?
ตู้แช่แข็งควบคุมอุณหภูมิ -
1️⃣ ตั้งโปรแกรมอุปกรณ์ให้ลดอุณหภูมิลงอย่าง
ค่อยเป็นค่อยไป 2️⃣ วางเซลล์ที่เตรียมไว้ในช่องแช่แข็ง 3️⃣
หลังจากสิ้นสุดรอบการแช่แข็ง ย้ายเซลล์ไปยังไนโตรเจนเหลว
- เก็บขวดแช่แข็งที่อุณหภูมิต่ำกว่า -130°C หรือในไนโตรเจนเหลวสำหรับการเก็บรักษาในระยะยาว
วัสดุและสารรีเอเจนต์
- 1–2 มิลลิลิตร หลอดแช่แข็ง
- หน่วยแช่แข็ง CoolCell® หรือตู้แช่แข็งควบคุมอุณหภูมิ
- สารละลายแช่แข็งป้องกันความเสียหายจากความเย็น (เช่น สารละลายป้องกันความเย็นแบบทำเอง, CM-1, CM-ACF หรือสารละลายเฉพาะทาง)
- เซรั่มจากตัวอ่อนวัว (FBS) หรือ สื่อเพาะเลี้ยงที่ปรับสภาพแล้ว
- ดีเอ็มเอสโอ หรือ กลีเซอรอล
- PBS ที่ปราศจากแคลเซียมและแมกนีเซียม
- Accutase, Trypsin หรือ Trypsin-EDTA (สำหรับเซลล์ที่เกาะติด)
- หลอดฟอลคอนขนาด 15 มิลลิลิตร หรือ 50 มิลลิลิตร
- เครื่องนับเซลล์เลือดหรือเครื่องนับเซลล์อัตโนมัติ
- เครื่องปั่นเหวี่ยง