เซลล์ต้นกำเนิดจากมนุษย์

เซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์คืออะไร?

เซลล์ต้นกำเนิดเป็นตัวอย่างที่บริสุทธิ์ที่สุดของเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง. เซลล์เหล่านี้ถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อและผ่านการประมวลผลเพื่อให้สามารถตั้งตัวได้ในสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมสำหรับการเพาะเลี้ยง. พวกมันเลียนแบบสภาวะในร่างกายจริงได้ใกล้เคียงกว่าและแสดงสรีรวิทยาปกติ เนื่องจากได้มาจากเนื้อเยื่อจริงแทนที่จะถูกดัดแปลง ด้วยเหตุนี้ จึงสามารถใช้เป็นแบบจำลองที่มีประโยชน์สำหรับการวิจัยด้านเภสัชวิทยาของเซลล์ พิษวิทยา และสรีรวิทยา (รวมถึงการศึกษาเกี่ยวกับการเผาผลาญ การชราภาพ และการส่งผ่านสัญญาณ) โปรดทราบว่าเซลล์ต้นกำเนิดมีความท้าทายในการเพาะเลี้ยงและรักษาให้คงอยู่มากกว่าเซลล์สายพันธุ์ต่อเนื่อง เนื่องจากมีอายุการใช้งานที่สั้นกว่า และจะหยุดการแบ่งตัว (หรือเข้าสู่ภาวะชรา) หลังจากจำนวนการแบ่งตัวที่กำหนดไว้ การศึกษาเส้นทางการส่งสัญญาณของเซลล์มีความซับซ้อนเนื่องจากความแปรปรวนที่มีอยู่ในเซลล์ต้นกำเนิดซึ่งได้มาจากผู้บริจาคและผ่านกระบวนการเพาะเลี้ยง ก่อนที่จะเริ่มการศึกษาการส่งสัญญาณ นักวิจัยมักจะทำการคัดกรองเพื่อตรวจสอบว่าเซลล์ตอบสนองต่อสิ่งกระตุ้นที่ใช้กันทั่วไปหรือไม่ เพื่อหลีกเลี่ยงการเสียเวลาและค่าใช้จ่าย เซลล์ต้นกำเนิดสามารถถูกกระตุ้นให้เปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณหลักก่อนที่จะถูกคัดกรอง

ทำไมต้องใช้เซลล์ต้นกำเนิดจากมนุษย์?

เซลล์ไลน์ที่คงสภาพอยู่ได้ถูกนำมาใช้เป็นแบบทดสอบเซลล์อย่างแพร่หลาย แม้ว่านักวิทยาศาสตร์จะยอมรับว่าการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพที่เกิดจากเซลล์ไลน์อาจเป็นอันตรายต่อการศึกษาความสำคัญทางสรีรวิทยาของเซลล์เหล่านั้น การใช้เซลล์ต้นกำเนิดจากมนุษย์ช่วยเพิ่มคุณค่าทางสรีรวิทยาของข้อมูลที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเซลล์ และเซลล์ต้นกำเนิดจากมนุษย์ได้รับการยอมรับมากขึ้นว่ามีความสำคัญต่อการศึกษาการกระบวนการทางชีวภาพ การก้าวหน้าของโรค และการพัฒนายา

เซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในงานวิจัยในหลอดทดลองเกี่ยวกับการสื่อสารระหว่างเซลล์และภายในเซลล์ ชีววิทยาการพัฒนา และกลไกที่อยู่เบื้องหลังโรคมะเร็ง โรคพาร์กินสัน และโรคเบาหวาน รวมถึงงานวิจัยทางชีววิทยาเบื้องต้นและเชิงสำรวจในด้านอื่นๆ อีกมากมาย นักวิจัยได้ใช้เซลล์ไลน์ที่ไม่สามารถตายได้มาเป็นเวลานานเพื่อศึกษาการทำงานของเนื้อเยื่อ อย่างไรก็ตาม เซลล์ไลน์ที่มีการกลายพันธุ์อย่างชัดเจนและความผิดปกติของโครโมโซมอาจไม่เป็นตัวแทนที่ดีสำหรับเซลล์ปกติและการพัฒนาของโรคในระยะเริ่มแรก ขณะนี้สามารถสร้างแบบจำลองที่แม่นยำยิ่งขึ้นของเซลล์ชนิดเฉพาะในเนื้อเยื่อได้ โดยใช้เซลล์ต้นกำเนิดจากมนุษย์ที่แยกได้จากเนื้อเยื่อนั้น และเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดร่วมกับสารเสริมที่เหมาะสม

อะไรคือการเพาะเลี้ยงเซลล์ปฐมภูมิ?

แทนที่จะใช้สายเซลล์ที่คงสภาพความเป็นอมตะ การเพาะเลี้ยงเซลล์ปฐมภูมิเกี่ยวข้องกับการเพาะเลี้ยงเซลล์โดยตรงจากสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์ภายนอกร่างกาย การยอมรับทางกฎหมายมีอยู่ในบางประเทศ เช่น สหราชอาณาจักร สำหรับข้อเท็จจริงที่ว่าการเพาะเลี้ยงเซลล์ปฐมภูมิเป็นตัวแทนของเนื้อเยื่อในร่างกายมากกว่าสายเซลล์ อย่างไรก็ตาม เซลล์ต้นกำเนิดต้องการสารตั้งต้นและสารอาหารที่เหมาะสมเพื่อเจริญเติบโต และหลังจากจำนวนการแบ่งตัวที่แน่นอน เซลล์จะพัฒนาเป็นฟีโนไทป์เสื่อมที่ทำให้เซลล์หยุดการแบ่งตัวอย่างถาวร ปัจจัยทั้งสองนี้เป็นแรงจูงใจในการสร้างสายพันธุ์เซลล์ ทั้งเซลล์ต้นกำเนิดที่ถูกทำให้เป็นอมตะตามธรรมชาติ (เช่น เซลล์ HeLa) และเซลล์ต้นกำเนิดที่ถูกทำให้เป็นอมตะโดยวิธีทางวิทยาศาสตร์ (เช่น เซลล์ HEK) สามารถเพาะเลี้ยงในวัฒนธรรมเซลล์ได้อย่างไม่มีกำหนด

เซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์ตามประเภทของเนื้อเยื่อ

เซลล์เยื่อบุผิว, ไฟโบรบลาสต์, เคราติโนไซต์, เมลาโนไซต์, เซลล์เยื่อบุหลอดเลือด, เซลล์กล้ามเนื้อ, เซลล์ภูมิคุ้มกัน, และเซลล์ต้นกำเนิด เช่น เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน เป็นเซลล์ต้นกำเนิดจากมนุษย์ที่ใช้บ่อยที่สุดในทางการศึกษาทางวิทยาศาสตร์ เริ่มต้นด้วย วัฒนธรรมเหล่านี้มีความหลากหลาย (แสดงถึงการผสมผสานของชนิดเซลล์ที่มีอยู่ในเนื้อเยื่อ) และสามารถรักษาชีวิตไว้ได้เฉพาะในหลอดทดลองเป็นระยะเวลาที่จำกัดเท่านั้น การเปลี่ยนแปลงเป็นกระบวนการในหลอดทดลองที่ช่วยให้เซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์สามารถถูกจัดการเพื่อการเพาะเลี้ยงซ้ำได้ไม่จำกัดจำนวนครั้ง การเปลี่ยนแปลงสามารถเกิดขึ้นได้ตามธรรมชาติ หรืออาจถูกกระตุ้นโดยสารเคมีหรือไวรัสได้เช่นกัน หลังจากผ่านการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมแล้ว วัฒนธรรมต้นกำเนิดสามารถแบ่งตัวได้ไม่จำกัดจำนวนเป็นสายเซลล์ทุติยภูมิที่ไม่มีวันตายได้ หากได้รับสารอาหารและพื้นที่เพียงพอ

เซลล์บุผนังหลอดเลือด

การรักษามะเร็ง, การหายของแผล, การวิจัยการส่งสัญญาณของเซลล์, การคัดกรองแบบปริมาณสูงและเนื้อหาสูง, และการคัดกรองทางพิษวิทยา เป็นเพียงบางส่วนของสาขาที่สามารถได้รับประโยชน์จากการใช้เซลล์เยื่อบุผิวต้นกำเนิดเป็นเครื่องมือในการวิจัย

เคราติโนไซต์

เคราติโนไซต์ ซึ่งได้มาจากผิวหนังชั้นนอกของผิวหนังผู้ใหญ่หรือหนังหุ้มปลายของทารกแรกเกิด มีบทบาทสำคัญในการศึกษาโรคผิวหนังเช่นโรคสะเก็ดเงินและมะเร็ง

เซลล์เยื่อบุผิว

จากการศึกษาเกี่ยวกับโรคมะเร็งไปจนถึงการตรวจสอบทางพิษวิทยา เซลล์เยื่อบุผิวปฐมภูมิได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นทรัพยากรที่มีคุณค่าอย่างยิ่งสำหรับการสร้างแบบจำลองกลไกป้องกันตามธรรมชาติของร่างกาย

ไฟโบรบลาสต์

การเหนี่ยวนำเซลล์ต้นกำเนิดพลูริโพเทนท์ (iPS) และการศึกษาการสมานแผลเป็นเพียงไม่กี่ตัวอย่างของการใช้งานที่หลากหลายของไฟโบรบลาสต์ปฐมภูมิ

เซลล์ภูมิคุ้มกัน

เซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดโมโนนิวเคลียร์จากเลือดส่วนปลาย หรือที่เรียกย่อว่า PBMC เป็นเซลล์เม็ดเลือดที่มีนิวเคลียสเป็นรูปวงกลมและมีนิวเคลียสเพียงหนึ่งเดียว เซลล์เหล่านี้ประกอบด้วยลิมโฟไซต์และโมโนไซต์เป็นหลัก ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน เซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดโมโนไซติกในเลือดส่วนปลายมักถูกนำมาใช้เพื่อวินิจฉัยการติดเชื้อหรือเพื่อตรวจหาการป้องกันที่อาจเกิดขึ้นจากการฉีดวัคซีน การเข้าใจถึงการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ที่เกิดจากเซลล์ที (T cells) มักมีความสำคัญอย่างยิ่ง

เมลาโนไซต์

เซลล์เมลาโนไซต์ ซึ่งเป็นเซลล์ผิวหนังที่มีความเฉพาะตัวในการผลิตเม็ดสีเมลานิน มีประโยชน์อย่างมากในการนำมาใช้เป็นแบบจำลองสำหรับการวิจัยในหัวข้อต่าง ๆ เช่น การหายของแผล, ความเป็นพิษ, มะเร็งผิวหนัง, การตอบสนองของผิวหนังต่อรังสีอัลตราไวโอเลต (UV), โรคผิวหนัง, และเครื่องสำอาง

เซลล์ต้นกำเนิด

เซลล์ต้นกำเนิดมีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดต่าง ๆ มากมาย เนื่องจากความสามารถในการเปลี่ยนแปลงนี้ ทำให้เซลล์ต้นกำเนิดมอบโอกาสใหม่ ๆ ในการจำลองเนื้อเยื่อของมนุษย์และภาวะสุขภาพ

เซลล์ต้นกำเนิดเมเซนไคม์

เซลล์ต้นกำเนิดชนิดมีเซนไคม์ หรือที่รู้จักในชื่อ MSCs สามารถได้มาจากแหล่งต่าง ๆ ของมนุษย์ เช่น ไขกระดูก ไขมัน (เนื้อเยื่อไขมัน) เนื้อเยื่อสายสะดือ (วอร์ตันเจลลี่) และน้ำคร่ำ (ของเหลวที่ล้อมรอบทารกในครรภ์) และสามารถขยายจำนวนได้ในหลอดทดลอง เซลล์ต้นกำเนิดสเต็มเซลล์ในเนื้อเยื่อผู้ใหญ่เหล่านี้มีความสามารถในการพัฒนาเป็นเซลล์หลากหลายชนิด เซลล์บางชนิดที่กล่าวถึงได้แก่ เซลล์กระดูก เซลล์กระดูกอ่อน เซลล์กล้ามเนื้อ เซลล์ประสาท เซลล์ผิวหนัง และเซลล์กระจกตา

เซลล์กล้ามเนื้อเรียบ

ภายในอวัยวะกลวง เซลล์กล้ามเนื้อเรียบปฐมภูมิ (SMCs) จะเรียงตัวอยู่ภายในและควบคุมการหดตัว นอกเหนือจากมะเร็งและโรคอื่นๆ แล้ว SMCs ยังสามารถใช้เป็นแบบจำลองสำหรับภาวะพังผืดในโรคความดันโลหิตสูงได้อีกด้วย

เซลล์ปฐมภูมิและสายพันธุ์เซลล์

ไม่ว่าจะเป็นการกลายพันธุ์โดยธรรมชาติ เช่น ในเซลล์มะเร็งที่เปลี่ยนแปลงไป หรือผ่านการเปลี่ยนแปลงโดยเจตนา เช่น ในการผลิตยีนมะเร็งเทียม เซลล์ต่อเนื่องได้มีศักยภาพในการสืบพันธุ์อย่างไม่มีที่สิ้นสุด (การเป็นอมตะ) โดยทั่วไปแล้ว เซลล์ต่อเนื่องมีความน่าเชื่อถือและสะดวกในการจัดการมากกว่าเซลล์ต้นกำเนิด พวกมันสามารถขยายตัวได้ไม่จำกัดและให้การเข้าถึงข้อมูลที่จำเป็นได้อย่างรวดเร็ว การใช้เซลล์ไลน์ต่อเนื่องมีข้อจำกัดบางประการ รวมถึงข้อเท็จจริงที่ว่าเซลล์เหล่านี้ถูกดัดแปลงพันธุกรรม/เปลี่ยนแปลง ซึ่งอาจทำให้ลักษณะทางสรีรวิทยาเปลี่ยนแปลงไปและไม่ตรงกับสภาพในร่างกายจริง และสิ่งนี้อาจเปลี่ยนแปลงเพิ่มเติมเมื่อเวลาผ่านไปกับการผ่านรุ่นจำนวนมาก

ความก้าวหน้าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิด

เซลล์ต้นกำเนิดมีชื่อเสียงที่ไม่ดีนักในเรื่องของการทำงานที่ยากลำบาก อย่างไรก็ตาม กระบวนการนี้กำลังกลายเป็นเรื่องง่ายกว่าที่เคยเป็นมา ด้วยการพัฒนาในด้านการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิด การมีเซลล์ต้นกำเนิดเชิงพาณิชย์ที่มีโปรโตคอลที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมอย่างเต็มที่ และการวิเคราะห์เทคนิคใหม่ที่ต้องการการป้อนข้อมูลน้อยลง

การเปลี่ยนแปลงจากการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบสองมิติไปสู่แบบสามมิติถือเป็นก้าวสำคัญในสาขานี้ โครงสร้างเฉพาะของเนื้อเยื่อ การปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ และการส่งสัญญาณทางกล/ชีวเคมีอาจลดลงในวัฒนธรรมแบบ 2 มิติ ดังนั้นจึงมีขีดจำกัดในคุณค่าทางชีวภาพของการเพาะเลี้ยงเหล่านี้

ในทางกลับกัน การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติช่วยให้เซลล์สามารถขยายตัวและโต้ตอบกับโครงข่ายนอกเซลล์แบบสามมิติได้ ซึ่งทำให้เซลล์สามารถโต้ตอบกันเองและกับเมทริกซ์นอกเซลล์ได้มากขึ้น ส่งผลให้การเพาะเลี้ยงแบบ 3 มิติมีความเกี่ยวข้องกับสรีรวิทยาของร่างกายมากขึ้น ความแม่นยำของวิธีการนี้ในการทำนายการตอบสนองในร่างกายจริงได้ทำให้เกิดการปฏิวัติในสาขาต่างๆ เช่น การค้นคว้าและพัฒนายา ด้วยเหตุนี้ เทคโนโลยีล้ำสมัย เช่น ออร์กาโนอยด์ที่ได้จากผู้ป่วยและอวัยวะบนชิป จึงให้แบบจำลองที่มีบริบทสูงสำหรับการคัดกรองและพัฒนายา

การสร้างเซลล์ต้นกำเนิดเป็นคอขวดในวัฒนธรรมเซลล์ต้นกำเนิด โดยปกติแล้วจำเป็นต้องใช้เนื้อเยื่อในปริมาณที่มากขึ้นเพื่อแก้ไขปัญหานี้ ซึ่งอาจเป็นเรื่องที่ทำได้ยาก อย่างไรก็ตาม ความไวในการวิเคราะห์ที่ดีขึ้นได้เปิดทางให้สามารถดำเนินการต่อไปได้ ตัวอย่างเช่น ความจำเป็นในการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดในปริมาณมากสามารถลดลงได้ด้วยการใช้เทคโนโลยีเซลล์เดี่ยว ซึ่งรวมถึงการหาลำดับพันธุกรรม การทดสอบเวสเทิร์นบลอตติ้ง และการวัดมวลเซลล์

แนวโน้มที่มีอนาคตสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิด

ความยากลำบากโดยรวมของการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดกำลังถูกบรรเทาลงด้วยความก้าวหน้าทางเทคโนโลยี ซึ่งส่งผลให้วิธีการนี้กำลังเข้ามาแทนที่วิธีอื่น ๆ อย่างรวดเร็วในฐานะมาตรฐานทองคำในการศึกษาและปฏิบัติทางชีววิทยาเซลล์และโมเลกุล การผลิตวัคซีน การปลูกถ่ายอวัยวะ การบำบัดด้วยเซลล์ต้นกำเนิด การวิจัยมะเร็ง และอื่น ๆ อีกมากมายจะได้รับประโยชน์อย่างมากจากความก้าวหน้าอย่างต่อเนื่องในการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิด

เคล็ดลับและเทคนิคการเพาะเลี้ยงเซลล์เบื้องต้น

ความต้องการของการขยายเซลล์

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดที่พบได้บ่อยที่สุดสองวิธีคือ การเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยหรือบนพื้นผิว (2 มิติ) เซลล์บางชนิดสามารถลอยอยู่ในกระแสเลือดได้อย่างอิสระโดยไม่ติดกับพื้นผิว (เช่น เซลล์ที่ได้จากเลือดส่วนปลาย) เซลล์ไลน์ต่าง ๆ ได้รับการดัดแปลงทางพันธุกรรมให้เจริญเติบโตได้ดีในวัฒนธรรมแบบแขวนลอย ซึ่งสามารถทำให้มีความหนาแน่นสูงกว่าการเจริญเติบโตในสภาพ 2 มิติ เซลล์ต้นกำเนิดที่ต้องการยึดเกาะเพื่อเจริญเติบโตในหลอดทดลองเรียกว่าเซลล์ยึดเกาะ (adherent cells) ซึ่งรวมถึงเซลล์ที่พบในเนื้อเยื่อแข็ง เพื่อปรับปรุงคุณสมบัติการยึดเกาะและส่งสัญญาณอื่น ๆ ที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตและการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ เซลล์เหล่านี้มักจะถูกเพาะเลี้ยงในภาชนะพลาสติกเรียบที่ไม่มีการเคลือบ แต่บางครั้งอาจใช้ไมโคร-แคร์ริเออร์แทน ตัวเลือกหลังนี้อาจมีการเคลือบด้วยโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ (เช่น คอลลาเจนและลามินิน) สื่อที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ประกอบด้วยอาหารพื้นฐานที่ได้รับการเสริมด้วยปัจจัยการเจริญเติบโตและไซโตไคน์ที่เหมาะสม เครื่องอบเซลล์เป็นเครื่องอบในห้องปฏิบัติการชนิดพิเศษที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงและรักษาเซลล์ให้อยู่ในอุณหภูมิและความเข้มข้นของก๊าซที่เหมาะสม (โดยทั่วไปคือ 37 °C, 5% CO2 สำหรับเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ที่ถูกเพาะเลี้ยง สภาวะที่เหมาะสมอาจแตกต่างกันอย่างมาก ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ที่ถูกเพาะเลี้ยง สารอาหารที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเจริญเติบโตจะมีปัจจัยที่ผสมผสานกันอย่างเฉพาะตัว ซึ่งอาจรวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง ค่า pH ความเข้มข้นของกลูโคส ปัจจัยการเจริญเติบโต และการมีอยู่ของสารอาหารอื่น ๆ

ยาปฏิชีวนะในอาหารเลี้ยงเชื้อมีความสำคัญอย่างยิ่งในระหว่างการตั้งต้นการเพาะเลี้ยงขั้นต้นเพื่อป้องกันการปนเปื้อนจากเนื้อเยื่อของโฮสต์ บางแผนการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะมีการใช้ยาปฏิชีวนะหลายชนิดร่วมกัน ได้แก่ เจนตามัยซิน, เพนิซิลลิน, สเตรปโตมัยซิน, และแอมฟotericin B อย่างไรก็ตาม การใช้ยาปฏิชีวนะเป็นเวลานานไม่แนะนำ เนื่องจากบางสาร (เช่น แอมฟotericin B) อาจเป็นพิษต่อเซลล์ในระยะยาว

เซลล์หลักส่วนใหญ่จะผ่านกระบวนการชราภาพและหยุดการแบ่งตัวหลังจากจำนวนครั้งที่เซลล์เพิ่มจำนวนถึงระดับหนึ่ง ทำให้การรักษาชีวิตเซลล์เหล่านี้ให้คงอยู่ได้หลังการแยกตัวมีความสำคัญอย่างยิ่ง การคงสภาพเซลล์ในระยะยาวต้องการเทคนิคการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เชี่ยวชาญและสภาพแวดล้อมที่เหมาะสม (รวมถึงอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม อุณหภูมิที่เหมาะสม ส่วนผสมของก๊าซที่เหมาะสม ค่า pH ที่เหมาะสม ความเข้มข้นของปัจจัยการเจริญเติบโตที่เหมาะสม การมีสารอาหาร และการมีกลูโคส) เนื่องจากปัจจัยการเจริญเติบโตหลายชนิดที่ใช้ในการเสริมอาหารเลี้ยงเชื้อได้มาจากเลือดสัตว์ (ส่วนผสมที่ได้จากเลือดมีศักยภาพในการปนเปื้อน) จึงแนะนำให้ลดการใช้หรือหลีกเลี่ยงการใช้โดยสิ้นเชิง นอกจากนี้ยังสำคัญที่จะต้องใช้เทคนิคปลอดเชื้อ

วัฒนธรรมย่อยและการรักษา

เมื่อเซลล์ที่แยกตัวติดกับพื้นผิวของจานเพาะเลี้ยง นี่ถือเป็นจุดเริ่มต้นของระยะการคงสภาพ การยึดเกาะมักเกิดขึ้น 24 ชั่วโมงหลังจากการเริ่มเพาะเลี้ยง ควรทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ย่อยเมื่อเซลล์ถึงเปอร์เซ็นต์การรวมตัวกันในระดับหนึ่งและกำลังแบ่งตัวอย่างต่อเนื่อง เนื่องจากเซลล์หลังการรวมตัวอาจเกิดการเปลี่ยนแปลงทางลักษณะและมีการเพิ่มจำนวนที่ช้าลงหลังการผ่านผ่าน จึงเป็นการดีที่สุดที่จะทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ย่อยก่อนที่เซลล์จะถึง 100% ของการรวมตัว

การเพาะเลี้ยงเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่ช่วยรักษาการเจริญเติบโตแบบทวีคูณของเซลล์ที่ขึ้นกับพื้นผิว การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบชั้นเดียวในอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่จะรบกวนการปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และภายในเซลล์ ใช้เอนไซม์โปรตีโอไลติกที่มีความเข้มข้นต่ำ เช่น ไตรพซิน/EDTA เพื่อสกัดเซลล์ปฐมภูมิที่เกาะติดจากชั้นเดียวหรือเนื้อเยื่อ หลังจากแยกและเจือจางเป็นสารละลายเซลล์เดี่ยวแล้ว เซลล์จะถูกนับและถ่ายโอนไปยังภาชนะเพาะเลี้ยงใหม่เพื่อให้เกาะติดและเพิ่มจำนวน

การแช่แข็งและการฟื้นฟู

การแช่แข็งเซลล์เพื่อเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตไว้โดยการแช่แข็งที่อุณหภูมิต่ำ การแช่แข็งเซลล์เพื่อเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตไว้โดยการแช่แข็งที่อุณหภูมิต่ำ การแช่แข็งเซลล์เพื่อเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตไว้โดยการแช่แข็งที่อุณหภูมิต่ำ การแช่แข็งเซลล์เพื่อเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตไว้โดยการแช่แข็งที่อุณหภูมิต่ำ การแช่แข็งเซลล์เพื่อเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตไว้โดยการแช่แข็งที่อุณหภูมิต่ำ การแช่แข็งเซลล์เพื่อเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตไว้โดยการแช กระบวนการแช่แข็งต้องเป็นไปอย่างค่อยเป็นค่อยไป ที่อุณหภูมิ -1 °C ต่อนาที เพื่อป้องกันการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง การเก็บรักษาในระยะยาวต้องใช้ไนโตรเจนเหลว (-196 °C) หรืออุณหภูมิต่ำกว่า -130 °C

การแช่เซลล์ที่แช่แข็งในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลาประมาณ 1 ถึง 2 นาที เป็นวิธีเดียวที่เพียงพอในการละลายเซลล์ที่เก็บรักษาด้วยความเย็น เซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์ไม่ควรถูกปั่นเหวี่ยงหลังจากละลายออกจากช่องแช่แข็ง (เนื่องจากมีความไวต่อการเสียหายอย่างมากในระหว่างการฟื้นฟูจากการเก็บรักษาด้วยความเย็น) เหมาะสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ทันทีหลังการละลาย และช่วยส่งเสริมการยึดเกาะของเซลล์ในระหว่างการเพาะเลี้ยงในช่วง 24 ชั่วโมงแรกหลังการเพาะเลี้ยง 1 หลังจากที่เซลล์ต้นกำเนิดที่ถูกแช่แข็งยึดเกาะแล้ว ต้องนำสื่อเพาะเลี้ยงที่ใช้แล้วออก (เนื่องจาก DMSO เป็นอันตรายต่อเซลล์ต้นกำเนิดและอาจทำให้ความสามารถในการอยู่รอดหลังการละลายลดลง)