เผยแพร่: 2023 | ปรับปรุงล่าสุด: พฤษภาคม 2026

เทคนิคการแยกเซลล์จากการเพาะเลี้ยง

การแยกเซลล์จากการเพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนสำคัญในการดูแลรักษาเซลล์เพาะเลี้ยง กระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับการทำให้เซลล์หลุดออกจากพื้นผิวที่เจริญเติบโต เพื่อเตรียมสำหรับการเพาะเลี้ยงต่อหรือการเก็บเกี่ยวเซลล์ ส่วนนี้จะกล่าวถึงวิธีการหลักสองวิธี ได้แก่ การใช้สารละลายบัฟเฟอร์สำหรับการแยกเซลล์แบบปราศจากเอนไซม์ และการใช้สารเคมีที่มีเอนไซม์

การใช้บัฟเฟอร์การแยกเซลล์ที่ปราศจากเอนไซม์

วิธีนี้อ่อนโยนและรักษาความสมบูรณ์ของเซลล์โดยไม่ต้องใช้เอนไซม์:

1. การเตรียมตัว
   • ตรวจสอบให้แน่ใจว่าสารรีเอเจนต์ทั้งหมดถูกอุ่นให้ถึง 37°C ก่อนใช้งานเพื่อหลีกเลี่ยงการช็อกเซลล์
2. การนำอาหารเลี้ยงเชื้อออก
   • ทิ้งวัสดุเพาะเลี้ยงเก่าออกจากภาชนะเพาะเลี้ยง
3. การล้าง
   • ล้างเซลล์ชั้นเดียวด้วย PBS ที่ปราศจากแคลเซียมและแมกนีเซียม 5 มิลลิลิตรต่อขวด T75 หรือจานขนาด 100 มิลลิเมตร
   • เขย่าภาชนะเบา ๆ เป็นเวลา 30 ถึง 60 วินาที ที่อุณหภูมิห้อง
   • ดูดและทิ้งสารละลายที่ใช้ล้าง
   • ทำซ้ำขั้นตอนการล้างนี้อีกครั้ง
4. การแยกตัว
   • เติมสารละลาย Cell Dissociation Buffer ที่ปราศจากเอนไซม์ประมาณ 5 มิลลิลิตรลงในภาชนะ
   • เขย่าเบา ๆ ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ถึง 2 นาที แล้วตรวจสอบการแยกตัวภายใต้กล้องจุลทรรศน์
   • เคาะขวดหรือจานเบาๆ กับมือเพื่อทำให้เซลล์หลุดออกหากจำเป็น
   • หากเซลล์ติดแน่น ให้ปล่อยให้เซลล์อยู่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาเพิ่มเติม 2 ถึง 5 นาที และเคาะอีกครั้งหากจำเป็น โดยใช้บัฟเฟอร์สำหรับการแยกเซลล์เพิ่มเติม
   • เมื่อเซลล์ถูกแยกออกจากกันแล้ว ให้เติมอาหารเลี้ยงเซลล์แบบสมบูรณ์อย่างน้อย 5 มิลลิลิตร เพื่อปรับสมดุลของบัฟเฟอร์ที่ใช้ในการแยกเซลล์และทำให้เซลล์แขวนลอยอีกครั้ง
5. การตรวจสอบความเป็นไปได้
   • ตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ระหว่างการเพาะเลี้ยงซ้ำ โดยให้แน่ใจว่ายังคงอยู่เหนือ 90%

การใช้สารรีเอเจนต์อื่นสำหรับการแยกตัว

วิธีนี้อนุญาตให้ใช้สารละลายการแยกตัวต่าง ๆ:

1. การนำวัสดุที่ใช้แล้วออก
   • ทิ้งสื่อเก่าออกจากภาชนะเพาะเลี้ยง
2. การล้างเซลล์
   • ล้างเซลล์ด้วยสารละลายเกลือสมดุลที่ปราศจากแคลเซียมและแมกนีเซียม หรือใช้ EDTA
   • เติมสารละลายล้างอย่างเบามือลงทางด้านตรงข้ามกับเซลล์ แล้วเขย่าภาชนะเบา ๆ เป็นเวลา 1 ถึง 2 นาทีก่อนทิ้งสารละลายล้าง
3. การแยกตัว
   • ใช้สารละลายการแยกที่เลือกไว้ 2 ถึง 3 มิลลิลิตรต่อพื้นที่การเจริญเติบโต 25 ตารางเซนติเมตร โดยให้ครอบคลุมแผ่นเซลล์อย่างทั่วถึง
   • บ่มภาชนะที่อุณหภูมิ 37°C และเขย่าเบาๆ การแยกตัวมักเกิดขึ้นภายใน 5 ถึง 15 นาที ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ของเซลล์
   • สำหรับเซลล์ที่ดื้อรั้น การเคาะที่หลอดเลือดสามารถเร่งกระบวนการให้เร็วขึ้นได้
   • สังเกตเซลล์อย่างระมัดระวังเพื่อป้องกันการสัมผัสเกินและอาจเกิดความเสียหาย
4. การเก็บเกี่ยวเซลล์
   • เมื่อเซลล์หลุดออกจากกันทั้งหมดแล้ว ให้ปล่อยให้เซลล์รวมตัวกันที่ก้นภาชนะโดยตั้งภาชนะให้อยู่ในแนวตั้ง
   • เติมสื่อเลี้ยงเซลล์ให้ครบถ้วน จากนั้นกระจายและเก็บเซลล์โดยการดูดและปล่อยสารเลี้ยงเซลล์ผ่านชั้นเซลล์
   • นับและดำเนินการเพาะเลี้ยงต่อ

ในทั้งสองวิธีนี้ การกำหนดเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุดสำหรับแต่ละสายพันธุ์ของเซลล์ผ่านการสังเกตการณ์เชิงประจักษ์นั้นมีความสำคัญอย่างยิ่ง กระบวนการนี้ควรรักษาความมีชีวิตของเซลล์ไว้ ซึ่งควรมีการตรวจสอบเป็นประจำเพื่อให้เกินกว่าร้อยละ 90 ในระหว่างการเพาะเลี้ยงซ้ำ ขั้นตอนเหล่านี้ให้พื้นฐานแก่ผู้วิจัยเพื่อปรับให้เหมาะสมตามความต้องการและลักษณะเฉพาะของสายพันธุ์เซลล์ของตน

ภาพรวมของเทคนิคสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เกาะติด

การเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เกาะติดอย่างมีประสิทธิภาพจำเป็นต้องมีการแยกเซลล์ออกจากภาชนะเพาะเลี้ยง วิธีการต่างๆ ถูกนำมาใช้ ซึ่งแต่ละวิธีเหมาะสมกับชนิดของเซลล์และสภาวะที่แตกต่างกัน เมื่อเลือกวิธีการแยกเซลล์ สิ่งสำคัญคือต้องพิจารณาความต้องการเฉพาะของสายพันธุ์เซลล์และเป้าหมายของการทดลอง การตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์อย่างสม่ำเสมอ โดยมีเป้าหมายให้มากกว่า 90% ในเวลาที่ทำการเพาะเลี้ยงซ้ำ เป็นสิ่งจำเป็นอย่างยิ่งเพื่อสุขภาพที่ดีและผลผลิตที่ต่อเนื่องของวัฒนธรรมการเพาะเลี้ยง ต่อไปนี้คือภาพรวมของขั้นตอนเหล่านี้: