Przejdź do strony głównej
Koszyk 0,00 €*
Pokaż wszystkie kategorie Platformy do wysokoprzepustowego badania receptorów GPCR oparte na komórkach HEK Powrót

Wysokoprzepustowe platformy przesiewowe GPCR oparte na komórkach HEK

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą rodzinę białek błonowych w ludzkim genomie i stanowią około 34% wszystkich celów leków. W Cytion zdajemy sobie sprawę, że opracowanie skutecznych środków terapeutycznych ukierunkowanych na GPCR wymaga solidnych platform przesiewowych opartych na komórkach, zdolnych do dokładnego pomiaru aktywacji receptora w tysiącach do milionów związków. Komórki HEK293 stały się preferowanym gospodarzem do ekspresji GPCR i badań funkcjonalnych, oferując unikalne połączenie wydajnej ekspresji receptora, niskiego tła endogennego receptora i kompatybilności z różnymi formatami testów.

Kluczowe wnioski

  • Komórki HEK293 zapewniają idealne tło dla heterologicznej ekspresji GPCR przy minimalnych zakłóceniach ze strony endogennych receptorów
  • Wiele formatów testów - strumień wapnia, cAMP, rekrutacja β-arrestyn - umożliwia kompleksowe badanie szlaków
  • Zautomatyzowana obsługa cieczy i czytniki płytek umożliwiają przesiewanie z wydajnością przekraczającą 100 000 związków dziennie
  • Stabilne strategie rozwoju linii komórkowych równoważą wymagania dotyczące przepustowości ze spójnością testów
  • Wykrywanie stronniczego agonizmu wymaga multipleksowanych odczytów w różnych kaskadach sygnalizacyjnych
Wysokoprzepustowa platforma przesiewowa GPCR oparta na HEK293 Ścieżki sygnałowe GPCR GPCR Gαs ↑cAMP Gαq ↑Ca²⁺ β-arr Rekrutacja Technologie testów Strumień wapnia Fluo-4/Fura-2 FLIPR/Plate Reader testy cAMP HTRF/AlphaScreen GloSensor β-Arrestin PathHunter BRET/NanoBiT Gen reporterowy CRE-Luc NFAT-Luc Przepływ pracy HTS Wysiew komórek 384/1536 dołków Związek Dodatek Wykrywanie Odczyt Analiza Wybór trafienia Zalety HEK293 dla badań przesiewowych GPCR Niskie tło Minimalna endogenna ekspresja Ekspresja GPCR Czysty sygnał/szum Wysoka ekspresja Wydajna transfekcja Silne promotory CMV 10⁵-10⁶ receptorów/komórkę Kompletna sygnalizacja Wszystkie podtypy białka G Obecność białek adaptorowych Natywne sprzężenie szlaków Kompatybilność z testami Wytrzymałość w mikropłytkach Adaptacja zawiesiny Zautomatyzowane przetwarzanie Wskaźniki wydajności badań przesiewowych Format Studzienki/płytka Związki/dzień 96 dołków 96 5,000-10,000 384-studzienkowy 384 20,000-50,000 1536-studzienka 1536 100,000-500,000 3456-odwiert 3456 500,000-1,000,000+ Rozwój stabilnej linii komórkowej 1. Projekt wektora z markerem selekcyjnym 2. Transfekcja komórek rodzicielskich HEK293 3. Selekcja antybiotykowa (2-4 tygodnie) 4. Klonowanie pojedynczych komórek (FACS/rozcieńczenie ograniczające) 5. Badanie przesiewowe klonów pod kątem ekspresji/funkcji 6. Bankowanie komórek i testowanie stabilności Oś czasu: 3-6 miesięcy © Cytion - Umożliwienie odkrywania leków GPCR

Dlaczego komórki HEK293 doskonale sprawdzają się w badaniach przesiewowych GPCR

Komórki HEK293 stały się de facto standardem w testach funkcjonalnych GPCR ze względu na kilka nieodłącznych zalet. Po pierwsze, ich stosunkowo niska endogenna ekspresja GPCR minimalizuje sygnalizację tła, która mogłaby zmylić badania heterologicznych receptorów. W przeciwieństwie do niektórych linii komórkowych pochodzących z nowotworów, które wyrażają liczne GPCR na funkcjonalnie istotnych poziomach, komórki HEK293 zapewniają czyste płótno dla ekspresji receptorów.

Po drugie, komórki HEK293 wykazują ekspresję wszystkich głównych podklas białek G (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) na poziomach wystarczających do obsługi różnych sprzężeń receptorowych. Ten kompletny repertuar sygnalizacyjny umożliwia badanie natywnych interakcji receptor-białko G bez konieczności koekspresji specyficznych podjednostek białka G.

Po trzecie, komórki HEK293 są skutecznie transfekowane przy użyciu wielu klas odczynników, osiągając współczynniki transfekcji przekraczające 90%. Wydajność ta przekłada się na wysokie poziomy ekspresji receptorów - typowo od 10⁵ do 10⁶ receptorów na komórkę - zapewniając solidne okna sygnałowe nawet dla receptorów o skromnej wydajności sprzęgania.

Nasze komórki HEK293T (300189) oferują szczególnie wysoką wydajność transfekcji dla przejściowej ekspresji GPCR, co czyni je idealnymi do wstępnej charakterystyki receptora i rozwoju testów przed przystąpieniem do generowania stabilnej linii komórkowej.

Wybór formatu testu do badań przesiewowych GPCR

Testy strumienia wapnia: Receptory sprzężone z Gαq aktywują fosfolipazę C, wyzwalając uwalnianie wapnia z zapasów wewnątrzkomórkowych. Wrażliwe na wapń barwniki fluorescencyjne, takie jak Fluo-4, Fura-2 lub genetycznie zakodowane wskaźniki wapnia, umożliwiają pomiar tej reakcji w czasie rzeczywistym. Czytniki fluorescencji oparte na płytkach, takie jak FLIPR, mogą jednocześnie mierzyć stany przejściowe wapnia na całych płytkach 384- lub 1536-dołkowych, osiągając przepustowość przekraczającą 100 000 punktów danych dziennie.

testy cAMP: Receptory sprzężone z Gαs stymulują cyklazę adenylową, zwiększając wewnątrzkomórkowy cAMP, podczas gdy receptory sprzężone z Gαi hamują produkcję cAMP. Wiele technologii testowych wykrywa zmiany cAMP, w tym konkurencyjne testy immunologiczne (HTRF, AlphaScreen), podejścia oparte na biosensorach (GloSensor) i testy genów reporterowych (CRE-lucyferaza). Każda z nich oferuje wyraźne korzyści w zakresie czułości, kinetyki i wydajności.

rekrutacja β-arestyny: Aktywacja GPCR wyzwala rekrutację β-arestyny do receptora, proces mierzalny za pomocą testów komplementacji białek. Technologie takie jak PathHunter (komplementacja fragmentów enzymatycznych) i NanoBiT (rozszczepiona lucyferaza) zapewniają czułe, niezależne od szlaku odczyty mające zastosowanie w różnych klasach receptorów, niezależnie od preferencji sprzężenia z białkiem G.

Testy genów reporterowych: Transkrypcyjne systemy reporterowe mierzą zdarzenia sygnalizacyjne, oferując wzmocnienie, które zwiększa czułość. Reporter CRE-lucyferaza wykrywa aktywację szlaku cAMP, NFAT-lucyferaza reaguje na sygnalizację wapniową, a SRE-lucyferaza monitoruje wiele szlaków. Chociaż wolniejsze niż bezpośrednie pomiary drugiego przekaźnika, testy reporterowe zapewniają doskonały stosunek sygnału do tła.

Strategie rozwoju stabilnych linii komórkowych

Kampanie przesiewowe o wysokiej wydajności zazwyczaj wymagają stabilnych linii komórkowych wyrażających docelowy GPCR na stałych poziomach w miliardach dołków testowych. Rozwój stabilnej linii rozpoczyna się od zaprojektowania wektora zawierającego zarówno receptor, jak i selektywny marker, umożliwiając wzbogacenie stabilnie transfekowanych komórek.

Nasze komórki HEK293 (300192) służą jako standardowa linia rodzicielska do generowania stabilnych linii komórkowych. Po transfekcji i selekcji antybiotykowej (zwykle 2-4 tygodnie), komórki, które przeżyły, poddawane są klonowaniu pojedynczych komórek poprzez rozcieńczenie ograniczające lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Poszczególne klony są następnie ekspandowane i charakteryzowane pod kątem poziomu ekspresji receptora, wielkości odpowiedzi funkcjonalnej i odporności testu.

Krytyczne atrybuty jakości dla przesiewowych linii komórkowych obejmują stabilność ekspresji w dłuższym okresie czasu, spójną farmakologię w porównaniu ze standardami referencyjnymi oraz solidną wydajność w zminiaturyzowanych formatach płytek. Banki zakwalifikowanych komórek powinny zostać utworzone na wczesnym etapie kampanii przesiewowej, aby zapewnić stałą wydajność przez cały czas jej trwania.

Aby przyspieszyć czas, nasze komórki HEK293 EBNA (300264) umożliwiają stabilną ekspresję z wektorów episomalnych, potencjalnie skracając czas rozwoju przy jednoczesnym zachowaniu spójności ekspresji.

Miniaturyzacja i kwestie automatyzacji

Maksymalizacja wydajności badań przesiewowych wymaga miniaturyzacji do formatów 384-dołkowych, 1536-dołkowych, a nawet 3456-dołkowych. Komórki HEK293 dobrze przystosowują się do posiewu o wysokiej gęstości w zmniejszonych objętościach, chociaż optymalizacja gęstości komórek, warunków posiewu i czasu inkubacji może być wymagana dla każdego przejścia formatu.

Komórki HEK293 w formie zawiesiny oferują korzyści dla zautomatyzowanych procesów przesiewowych. Nasze komórki HEK293 adaptowane do zawiesiny (300686) można dozować bezpośrednio z naczyń hodowlanych na płytki testowe bez trypsynizacji, redukując etapy obsługi i poprawiając spójność. Ta kompatybilność ze zautomatyzowanymi urządzeniami do obsługi cieczy umożliwia prowadzenie prawdziwych kampanii przesiewowych.

Wymagania dotyczące stabilności płytek testowych różnią się w zależności od formatu. Testy strumienia wapnia zazwyczaj wymagają pomiaru w ciągu kilku godzin od załadowania barwnika, podczas gdy testy cAMP i β-arrestin mogą wymagać całonocnej inkubacji przed odczytem. Zrozumienie tych ograniczeń informuje o logistyce badań przesiewowych i planowaniu sprzętu.

Analiza danych i identyfikacja trafień

Kampanie przesiewowe GPCR generują ogromne zbiory danych wymagające solidnych potoków analitycznych. Parametry statystyczne, w tym współczynnik Z'-factor, stosunek sygnału do tła i współczynnik zmienności oceniają jakość testu na zasadzie płytka po płytce. Płytki nie spełniające progów jakości powinny być powtarzane, a nie analizowane.

Kryteria identyfikacji trafień równoważą czułość z odsetkiem wyników fałszywie dodatnich. Progi aktywności 50% aktywacji lub inhibicji w stosunku do związków referencyjnych zapewniają rozsądne punkty wyjścia, chociaż optymalne wartości graniczne zależą od składu biblioteki i celów programu. Potwierdzenie reakcji na stężenie pierwotnych trafień eliminuje artefakty i szereguje związki do dalszych badań.

Nowoczesne odkrywanie leków GPCR coraz częściej kładzie nacisk na tendencyjny agonizm - związki, które preferencyjnie aktywują pewne szlaki sygnałowe nad innymi. Wykrywanie tendencyjnych związków wymaga równoległych testów mierzących wiele ścieżek (np. aktywację białka G w porównaniu z rekrutacją β-arrestyn) ze zwróceniem szczególnej uwagi na czułość i kinetykę testu, aby uniknąć błędu technicznego.

Zalecane produkty do badań przesiewowych GPCR:

Ta strona używa plików cookie, aby zapewnić najlepszą jakość korzystania z naszej witryny... Więcej informacji.
- Imprint

Wykryliśmy, że znajdujesz się w innym kraju lub używasz innego języka przeglądarki niż aktualnie wybrany. Czy chcesz zaakceptować sugerowane ustawienia?

Zamknij