Ludzkie komórki pierwotne

Czym są ludzkie komórki pierwotne?

Komórki pierwotne są najczystszą reprezentacją odpowiednich tkanek. Są one izolowane z tkanki i przetwarzane w taki sposób, aby mogły zostać zasiedlone w środowisku hodowlanym o idealnych warunkach. Dokładniej naśladują stan in vivo i wykazują normalną fizjologię, ponieważ pochodzą z tkanki, a nie są modyfikowane. Z tego powodu mogą służyć jako użyteczne modele do badań nad farmakologią komórkową, toksykologią i fizjologią (w tym badań metabolizmu, starzenia się i transdukcji sygnału). Należy pamiętać, że komórki pierwotne są trudniejsze w hodowli i utrzymaniu niż ciągłe linie komórkowe, ponieważ mają krótszą żywotność i przestają się dzielić (lub starzeją się) po określonej liczbie podziałów komórkowych. Badania nad szlakami sygnalizacji komórkowej są skomplikowane ze względu na nieodłączną zmienność komórek pierwotnych pozyskiwanych od dawców i poprzez praktyki podhodowli. Przed rozpoczęciem badań nad sygnalizacją, naukowcy często przeprowadzają badania przesiewowe w celu ustalenia, czy komórki reagują na powszechnie stosowane bodźce. Aby uniknąć marnowania czasu i pieniędzy, komórki pierwotne mogą być stymulowane do aktywacji głównych szlaków sygnałowych przed badaniem przesiewowym.

Dlaczego warto używać ludzkich komórek pierwotnych?

Unieśmiertelnione linie komórkowe są powszechnie stosowane jako testy komórkowe. Chociaż naukowcy przyznali, że zmiany biologiczne spowodowane liniami komórkowymi mogą być szkodliwe w badaniu ich znaczenia fizjologicznego. Wykorzystanie ludzkich komórek pierwotnych poprawia wartość fizjologiczną danych uzyskanych za pomocą hodowli komórkowych i są one coraz częściej uważane za ważne dla badania procesów biologicznych, postępu choroby i opracowywania leków.

Ludzkie komórki pierwotne są szeroko stosowane w badaniach in vitro nad komunikacją międzykomórkową i wewnątrzkomórkową, biologią rozwoju i mechanizmami leżącymi u podstaw raka, choroby Parkinsona i cukrzycy, wśród wielu innych przedklinicznych i badawczych obszarów badań biologicznych. Naukowcy od dawna wykorzystują unieśmiertelnione linie komórkowe do badania funkcji tkanek; jednak linie komórkowe z oczywistymi mutacjami i nieprawidłowościami chromosomalnymi mogą nie być dobrymi substytutami normalnych komórek i rozwoju choroby we wczesnych stadiach. Dokładniejszy model określonego typu komórek tkankowych można obecnie uzyskać, stosując ludzkie komórki pierwotne wyizolowane z tej tkanki i utrzymywane w pożywkach i suplementach do pierwotnej hodowli komórkowej.

Czym jest pierwotna hodowla komórek?

Zamiast stosowania unieśmiertelnionych linii komórkowych, pierwotna hodowla komórkowa obejmuje hodowlę komórek bezpośrednio z organizmu wielokomórkowego poza ciałem. W niektórych krajach, takich jak Wielka Brytania, istnieje prawne uznanie faktu, że pierwotne kultury komórkowe są bardziej reprezentatywne dla tkanek in vivo niż linie komórkowe. Niemniej jednak, pierwotne komórki potrzebują odpowiedniego podłoża i składników odżywczych do wzrostu, a po pewnej liczbie podziałów rozwijają starzejący się fenotyp, który powoduje, że na stałe przestają się dzielić. Te dwa czynniki motywują do tworzenia linii komórkowych. Zarówno naturalnie unieśmiertelnione komórki pierwotne (np. komórki HeLa), jak i sztucznie unieśmiertelnione komórki pierwotne (np. komórki HEK) mogą być hodowane w nieskończoność w hodowli komórkowej.

Ludzkie komórki pierwotne według typów tkanek

Komórki nabłonkowe, fibroblasty, keratynocyty, melanocyty, komórki śródbłonka, komórki mięśniowe, komórki odpornościowe i komórki macierzyste, takie jak mezenchymalne komórki macierzyste, należą do najczęściej wykorzystywanych ludzkich komórek pierwotnych w badaniach naukowych. Po pierwsze, kultury te są heterogeniczne (reprezentują mieszankę typów komórek obecnych w tkance) i mogą być utrzymywane przy życiu in vitro tylko przez określony czas. Transformacja to proces in vitro, który umożliwia manipulowanie ludzkimi komórkami pierwotnymi w celu uzyskania nieograniczonej liczby podhodowli. Transformacja może zachodzić naturalnie lub może być indukowana przez substancje chemiczne lub wirusy. Po przejściu transformacji genetycznej, hodowla pierwotna może dzielić się w nieskończoność do unieśmiertelnionej wtórnej linii komórkowej, jeśli ma wystarczającą ilość składników odżywczych i przestrzeni.

Komórki śródbłonka

Leczenie raka, gojenie się ran, badania nad sygnalizacją komórkową, badania przesiewowe o wysokiej przepustowości i zawartości oraz badania toksykologiczne to tylko niektóre z obszarów, które mogą skorzystać z wykorzystania pierwotnych komórek śródbłonka jako narzędzia badawczego.

Keratynocyty

Keratynocyty, pochodzące z naskórka dorosłej ludzkiej skóry lub napletka noworodka, odgrywają kluczową rolę w badaniach nad chorobami skóry, takimi jak łuszczyca i rak.

Komórki nabłonkowe

Od badań nad rakiem po badania toksykologiczne, pierwotne komórki nabłonkowe okazały się nieocenionymi zasobami do modelowania naturalnych mechanizmów obronnych organizmu.

Fibroblasty

Indukowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) i badanie gojenia się ran to tylko kilka z wielu zastosowań pierwotnych fibroblastów.

Komórki odpornościowe

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, w skrócie PBMC, to jednojądrzaste komórki krwi z okrągłym jądrem komórkowym. Obejmują one głównie limfocyty i monocyty, które pełnią ważne funkcje w trakcie odpowiedzi immunologicznej. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są często wykorzystywane do diagnozowania infekcji lub wykrywania możliwej ochrony poszczepiennej. Wgląd w komórkową odpowiedź immunologiczną, w której pośredniczą limfocyty T, jest często kluczowy.

Melanocyty

Melanocyty, wyspecjalizowane komórki skóry, które produkują pigment melaninę, są pomocne jako modele do badań nad takimi tematami jak gojenie się ran, toksyczność, czerniak, odpowiedź skóry na promieniowanie ultrafioletowe (UV), choroby skóry i kosmetyki.

Komórki macierzyste

Komórki macierzyste mają potencjał do różnicowania się w wiele różnych typów komórek. Ze względu na ich zdolność do różnicowania, zapewniają one nowe możliwości modelowania ludzkich tkanek i warunków zdrowotnych.

Mezenchymalne komórki macierzyste

Mezenchymalne komórki macierzyste, znane również jako MSC, mogą być pozyskiwane z różnych ludzkich źródeł, takich jak szpik kostny, tłuszcz (tkanka tłuszczowa), tkanka pępowinowa (galaretka Whartona) i płyn owodniowy (płyn otaczający płód) i mogą być ekspandowane in vitro. Te dorosłe zrębowe komórki macierzyste mają zdolność do przekształcania się w wiele różnych typów komórek. Niektóre z tych typów komórek obejmują komórki kostne, komórki chrząstki, komórki mięśniowe, komórki nerwowe, komórki skóry i komórki rogówki.

Komórki mięśni gładkich

W wydrążonych narządach pierwotne komórki mięśni gładkich (SMC) wyściełają wnętrze i pośredniczą w kurczliwości. Oprócz raka i innych chorób, SMC mogą być wykorzystywane do modelowania zwłóknienia nadciśnienia.

Komórki pierwotne i linie komórkowe

Albo poprzez spontaniczną mutację, jak w przypadku transformowanych linii komórek nowotworowych, albo poprzez celową zmianę, jak w przypadku sztucznej produkcji genów nowotworowych, ciągłe linie komórkowe zyskały potencjał do rozmnażania się w nieskończoność (immortalizacji). Z reguły ciągłe linie komórkowe są bardziej niezawodne i wygodniejsze w obsłudze niż komórki pierwotne. Mogą one rozwijać się w nieskończoność i zapewniają szybki dostęp do istotnych danych. Korzystanie z ciągłych linii komórkowych ma pewne ograniczenia, w tym fakt, że są one genetycznie modyfikowane/transformowane, co może zmieniać cechy fizjologiczne i nie odpowiadać warunkom in vivo, a to może się dalej zmieniać w czasie wraz ze znacznym pasażowaniem.

Postępy w hodowli komórek pierwotnych

Komórki pierwotne cieszą się złą sławą jako trudne w obróbce. Proces ten staje się jednak łatwiejszy niż kiedykolwiek wcześniej dzięki rozwojowi pierwotnej hodowli komórek, dostępności komercyjnych komórek pierwotnych z w pełni zoptymalizowanymi protokołami oraz nowym technikom analizy, które wymagają mniejszego wkładu.

Przejście od dwuwymiarowej do trójwymiarowej hodowli komórek jest uważane za kamień milowy w tej dziedzinie. Architektura specyficzna dla tkanki, interakcje komórka-komórka oraz sygnalizacja mechaniczna/biochemiczna mogą być osłabione w hodowli 2D. W związku z tym wartość biologiczna tych kultur jest ograniczona.

Z drugiej strony, hodowla komórkowa 3D umożliwia komórkom ekspansję i interakcję z zewnątrzkomórkową strukturą 3D. Dzięki temu komórki mogą wchodzić w interakcje między sobą i z macierzą zewnątrzkomórkową, co sprawia, że hodowle 3D są bardziej istotne z fizjologicznego punktu widzenia. Dokładność tej metody w przewidywaniu reakcji in vivo sprawiła, że stała się ona rewolucyjna w dziedzinach takich jak odkrywanie i opracowywanie leków. Z tego powodu najnowocześniejsze technologie, takie jak organoidy pochodzące od pacjentów i narządy na chipie, zapewniają wysoce kontekstowe modele do badań przesiewowych i opracowywania leków.

Generowanie komórek pierwotnych jest wąskim gardłem w hodowli pierwotnej. Aby to przezwyciężyć, zwykle wymagana jest większa objętość tkanki, co może być trudne do osiągnięcia. Ulepszona czułość analityczna stanowi jednak drogę naprzód. Na przykład, potrzeba hodowli dużych ilości komórek pierwotnych jest zmniejszona dzięki zastosowaniu technologii pojedynczych komórek, która obejmuje sekwencjonowanie, western blotting i cytometrię masową.

Obiecujące perspektywy dla hodowli komórek pierwotnych

Ogólne trudności związane z hodowlą komórek pierwotnych są łagodzone przez postęp technologiczny. Z kolei ta metoda szybko zastępuje inne jako złoty standard w badaniach i praktyce biologii komórkowej i molekularnej. Produkcja szczepionek, zastępowanie narządów, terapie komórkami macierzystymi, badania nad rakiem i wiele innych mogą odnieść ogromne korzyści z ciągłego postępu w pierwotnej hodowli komórek.

Wskazówki i porady dotyczące pierwotnej hodowli komórek

Potrzeby ekspansji komórek

Dwie najpopularniejsze metody hodowli komórek pierwotnych to hodowla w zawiesinie lub na powierzchni (2D). Niektóre komórki są w stanie swobodnie unosić się w krwiobiegu, nigdy nie przylegając do powierzchni (na przykład te pochodzące z krwi obwodowej). Różne linie komórkowe zostały zaprojektowane tak, aby rozwijać się w hodowlach zawiesinowych, gdzie mogą osiągnąć gęstość nieosiągalną w warunkach wzrostu 2D. Komórki pierwotne, które potrzebują zakotwiczenia do wzrostu in vitro, nazywane są komórkami adherentnymi i obejmują komórki występujące w tkankach stałych. Aby poprawić właściwości adhezyjne i dostarczyć inne sygnały wymagane do wzrostu i różnicowania, komórki te są zwykle hodowane w płaskim, niepowlekanym plastikowym naczyniu, ale czasami w mikronośniku. Ta ostatnia opcja może być pokryta białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (takimi jak kolagen i laminina). Pożywka stosowana w hodowli komórkowej składa się z pożywki podstawowej, która została uzupełniona odpowiednimi czynnikami wzrostu i cytokinami. Inkubator komórkowy to specjalny rodzaj inkubatora laboratoryjnego wykorzystywanego do hodowli i utrzymywania komórek w określonej temperaturze i mieszaninie gazów (zazwyczaj 37 °C, 5% CO2 dla komórek ssaków). W zależności od rodzaju hodowanych komórek, optymalne warunki mogą być bardzo różne. W zależności od rodzaju hodowanych komórek, optymalna pożywka wzrostowa będzie miała unikalną kombinację czynników, w tym między innymi pH, stężenie glukozy, czynniki wzrostu i obecność innych składników odżywczych.

Antybiotyki w pożywce wzrostowej mają kluczowe znaczenie podczas zakładania hodowli pierwotnej, aby zapobiec zanieczyszczeniu tkanki gospodarza. Niektóre schematy antybiotykowe obejmują kombinację gentamycyny, penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B. Nie zaleca się jednak stosowania antybiotyków przez dłuższy czas, ponieważ niektóre odczynniki (takie jak amfoterycyna B) mogą być toksyczne dla komórek w dłuższej perspektywie.

Większość komórek pierwotnych przechodzi proces starzenia i przestaje się dzielić po określonej liczbie podwojeń populacji, co sprawia, że kluczowe jest utrzymanie ich przy życiu po izolacji. Długotrwała żywotność komórek wymaga specjalistycznych technik hodowli komórek i idealnych warunków hodowli (w tym odpowiedniej pożywki, odpowiedniej temperatury, odpowiedniej mieszaniny gazów, odpowiedniego pH, odpowiedniego stężenia czynników wzrostu, obecności składników odżywczych i obecności glukozy). Ponieważ wiele czynników wzrostu stosowanych do uzupełniania pożywek jest uzyskiwanych z krwi zwierzęcej (składniki pochodzące z krwi mają potencjał zanieczyszczenia), zaleca się zminimalizowanie lub całkowite unikanie ich stosowania. Ważne jest również stosowanie techniki aseptycznej.

Podhodowla i konserwacja

Kiedy komórki w izolacji przylegają do powierzchni naczynia hodowlanego, oznacza to początek fazy podtrzymywania. Przyłączenie następuje zazwyczaj 24 godziny po rozpoczęciu hodowli. Komórki powinny być subkulturowane, gdy osiągną określony procent konfluencji i aktywnie się replikują. Ponieważ komórki po konfluencji mogą ulegać różnicowaniu i wykazywać wolniejszą proliferację po przejściu, najlepiej jest podhodować pierwotne kultury komórkowe, zanim osiągną 100% konfluencji.

Podhodowla w świeżym podłożu utrzymuje wykładniczy wzrost komórek zależnych od zakotwiczenia. Subkultury monowarstwowe zakłócają interakcje między- i wewnątrzkomórkowe na powierzchni komórek. Niskie stężenia enzymów proteolitycznych, takich jak trypsyna/EDTA, są stosowane do ekstrakcji przylegających komórek pierwotnych z monowarstw lub tkanek. Po zdysocjowaniu i rozcieńczeniu do roztworu jednokomórkowego, komórki są liczone i przenoszone do świeżych pojemników hodowlanych w celu ponownego przyłączenia i namnożenia.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie

Kriokonserwacja pozwala zachować żywe komórki poprzez zamrożenie ich w niskich temperaturach. Kriokonserwacja i rozmrażanie ludzkich komórek pierwotnych zapobiega ich śmierci i uszkodzeniom podczas przechowywania i użytkowania. Ludzkie komórki pierwotne są kriokonserwowane przy użyciu DMSO lub glicerolu (w odpowiedniej temperaturze i z kontrolowaną szybkością zamrażania). Proces zamrażania musi przebiegać stopniowo, w temperaturze -1 °C co minutę, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu. Długotrwałe przechowywanie wymaga ciekłego azotu (-196 °C) lub temperatury poniżej -130 °C.

Do rozmrożenia kriokonserwowanych komórek wystarczy zanurzenie ich w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na około 1 do 2 minut. Ludzkie komórki pierwotne nie powinny być odwirowywane po rozmrożeniu z zamrażarki (ponieważ są one niezwykle wrażliwe na uszkodzenia podczas odzyskiwania z kriokonserwacji). Nadaje się do umieszczania komórek bezpośrednio po rozmrożeniu i promuje przyleganie w kulturach w ciągu pierwszych 24 godzin po umieszczeniu. 1 Po przyłączeniu kriokonserwowanych komórek pierwotnych należy usunąć zużytą pożywkę (ponieważ DMSO jest szkodliwe dla komórek pierwotnych i może powodować spadek żywotności po rozmrożeniu).