Pierwotne komórki ludzkie

Czym są pierwotne komórki ludzkie?

Komórki pierwotne stanowią najczystszy obraz tkanek, z których pochodzą. Są one izolowane z tkanki i przetwarzane w taki sposób, aby mogły się zadomowić w hodowli w idealnych warunkach. Bardziej wiernie odzwierciedlają stan in vivo i wykazują normalną fizjologię, ponieważ pochodzą z tkanki, a nie są modyfikowane. Dzięki temu mogą służyć jako przydatne modele w badaniach z zakresu farmakologii komórkowej, toksykologii i fizjologii (w tym w badaniach nad metabolizmem, starzeniem się i transdukcją sygnałów). Należy pamiętać, że hodowla i utrzymanie komórek pierwotnych jest trudniejsze niż w przypadku ciągłych linii komórkowych, ponieważ mają one krótszą żywotność i po określonej liczbie podziałów komórkowych przestają się dzielić (lub ulegają starzeniu). Badania szlaków sygnałowych komórek są skomplikowane ze względu na nieodłączną zmienność komórek pierwotnych pozyskanych od dawców oraz wynikającą z praktyk subkultury. Przed rozpoczęciem badań nad sygnalizacją naukowcy często przeprowadzają badania przesiewowe w celu ustalenia, czy komórki reagują na powszechnie stosowane bodźce. Aby uniknąć marnowania czasu i pieniędzy, komórki pierwotne można stymulować w celu aktywacji głównych szlaków sygnałowych przed przeprowadzeniem badań przesiewowych.

Dlaczego warto stosować ludzkie komórki pierwotne?

Nieśmiertelne linie komórkowe są powszechnie stosowane w testach komórkowych. Naukowcy uznają jednak, że zmiany biologiczne wynikające z użycia linii komórkowych mogą mieć negatywny wpływ na badanie ich znaczenia fizjologicznego. Wykorzystanie pierwotnych komórek ludzkich zwiększa wartość fizjologiczną danych uzyskanych z hodowli komórkowych, a komórki te są coraz częściej uznawane za istotne w badaniach procesów biologicznych, przebiegu chorób oraz rozwoju leków.

Ludzkie komórki pierwotne są szeroko stosowane w badaniach in vitro dotyczących komunikacji międzykomórkowej i wewnątrzkomórkowej, biologii rozwojowej oraz mechanizmów leżących u podstaw nowotworów, choroby Parkinsona i cukrzycy, a także w wielu innych obszarach badań przedklinicznych i badawczych z dziedziny biologii. Naukowcy od dawna wykorzystują nieśmiertelne linie komórkowe do badania funkcji tkanek; jednak linie komórkowe z oczywistymi mutacjami i nieprawidłowościami chromosomowymi mogą nie być dobrym substytutem normalnych komórek i przebiegu choroby we wczesnych stadiach. Obecnie można uzyskać dokładniejszy model konkretnego typu komórek tkankowych, wykorzystując pierwotne komórki ludzkie wyizolowane z tej tkanki i hodowane w pożywkach do hodowli komórek pierwotnych oraz z dodatkiem odpowiednich suplementów.

Czym jest hodowla komórek pierwotnych?

Zamiast korzystać z nieśmiertelnych linii komórkowych, hodowla komórek pierwotnych polega na hodowaniu komórek pochodzących bezpośrednio z organizmu wielokomórkowego poza ciałem. W niektórych krajach, takich jak Wielka Brytania, uznaje się prawnie, że hodowle komórek pierwotnych są bardziej reprezentatywne dla tkanek in vivo niż linie komórkowe. Niemniej jednak komórki pierwotne potrzebują odpowiedniego podłoża i składników odżywczych do wzrostu, a po pewnej liczbie podziałów rozwijają fenotyp starzenia, który powoduje, że trwale przestają się dzielić. Te dwa czynniki motywują do tworzenia linii komórkowych. Zarówno naturalnie unieśmiertelnione komórki pierwotne (np. komórki HeLa), jak i sztucznie unieśmiertelnione komórki pierwotne (np. komórki HEK) mogą być hodowane w nieskończoność w hodowli komórkowej.

Ludzkie komórki pierwotne według typów tkanek

Komórki nabłonkowe, fibroblasty, keratynocyty, melanocyty, komórki śródbłonka, komórki mięśniowe, komórki odpornościowe oraz komórki macierzyste, takie jak mezenchymalne komórki macierzyste, należą do najczęściej wykorzystywanych ludzkich komórek pierwotnych w badaniach naukowych. Po pierwsze, hodowle te są heterogeniczne (stanowią mieszankę typów komórek obecnych w tkance) i można je utrzymywać przy życiu in vitro tylko przez określony czas. Transformacja to proces in vitro, który pozwala na manipulowanie pierwotnymi komórkami ludzkimi w celu uzyskania nieograniczonej liczby subkultur. Transformacja może zachodzić naturalnie lub może być wywołana przez substancje chemiczne lub wirusy. Po przejściu transformacji genetycznej hodowla pierwotna może dzielić się w nieskończoność, tworząc nieśmiertelną linię komórkową wtórną, o ile zapewni się jej wystarczającą ilość składników odżywczych i przestrzeni.

Komórki śródbłonka

Leczenie nowotworów, gojenie ran, badania nad sygnalizacją komórkową, badania przesiewowe o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości oraz badania toksykologiczne to tylko niektóre z obszarów, w których wykorzystanie pierwotnych komórek śródbłonka jako narzędzia badawczego może przynieść korzyści.

Keratynocyty

Keratynocyty, pochodzące z naskórka dorosłego człowieka lub z napletka noworodka, odgrywają kluczową rolę w badaniach nad chorobami skóry, takimi jak łuszczyca i nowotwory.

Komórki nabłonkowe

Od badań nad nowotworami po badania toksykologiczne – pierwotne komórki nabłonkowe okazały się nieocenionym źródłem informacji przy modelowaniu naturalnych mechanizmów obronnych organizmu.

Fibroblasty

Indukowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) oraz badania nad gojeniem się ran to tylko niektóre z wielu zastosowań pierwotnych fibroblastów.

Komórki odpornościowe

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, w skrócie PBMC, to komórki jednojądrzaste krwi o okrągłym jądrze komórkowym. Obejmują one głównie limfocyty i monocyty, które pełnią ważne funkcje w trakcie odpowiedzi immunologicznej. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są często wykorzystywane do diagnozowania infekcji lub wykrywania ewentualnej ochrony szczepionkowej. Zrozumienie komórkowej odpowiedzi immunologicznej, w której pośredniczą komórki T, ma często kluczowe znaczenie.

Melanocyty

Melanocyty, wyspecjalizowane komórki skóry wytwarzające pigment melaninę, są przydatne jako modele badawcze w takich dziedzinach jak gojenie się ran, toksyczność, czerniak, reakcja skóry na promieniowanie ultrafioletowe (UV), choroby skóry oraz kosmetyki.

Komórki macierzyste

Komórki macierzyste mają potencjał różnicowania się w szeroką gamę typów komórek. Dzięki tej zdolności do różnicowania się otwierają nowe możliwości modelowania ludzkich tkanek i stanów zdrowotnych.

Mezenchymalne komórki macierzyste

Mezenchymalne komórki macierzyste, znane również jako MSC, można pozyskać z różnych źródeł ludzkich, takich jak szpik kostny, tkanka tłuszczowa, tkanka pępowinowa (galaretka Whartona) oraz płyn owodniowy (płyn otaczający płód), a także można je namnażać in vitro. Te dorosłe mezenchymalne komórki macierzyste mają zdolność przekształcania się w szeroką gamę typów komórek. Niektóre z tych typów komórek to komórki kostne, chrzęstne, mięśniowe, nerwowe, skórne oraz komórki rogówki.

Komórki mięśni gładkich

W narządach pustych pierwotne komórki mięśni gładkich (SMC) wyściełają wnętrze i odpowiadają za kurczliwość. Oprócz badań nad rakiem i innymi chorobami, komórki SMC mogą być wykorzystywane do modelowania zwłóknienia związanego z nadciśnieniem tętniczym.

Komórki pierwotne i linie komórkowe

Czy to w wyniku spontanicznej mutacji, jak w przypadku transformowanych linii komórkowych nowotworowych, czy też poprzez celową modyfikację, jak w przypadku sztucznego wytwarzania genów nowotworowych, linie komórkowe ciągłe zyskały zdolność do nieograniczonego rozmnażania się (zostały uwiecznione). Z reguły linie komórkowe ciągłe są bardziej niezawodne i wygodniejsze w pracy niż komórki pierwotne. Mogą one namnażać się w nieskończoność i zapewniają szybki dostęp do niezbędnych danych. Wykorzystanie ciągłych linii komórkowych wiąże się z pewnymi ograniczeniami, w tym z faktem, że są one genetycznie zmodyfikowane/przekształcone, co może wpływać na cechy fizjologiczne i powodować rozbieżności w stosunku do warunków in vivo, a także z tym, że cechy te mogą ulegać dalszym zmianom w miarę upływu czasu w wyniku znacznej liczby pasażowań.

Postępy w hodowli komórek pierwotnych

Komórki pierwotne mają opinię trudnych w pracy. Proces ten staje się jednak łatwiejszy niż kiedykolwiek wcześniej dzięki postępom w hodowli komórek pierwotnych, dostępności komercyjnych komórek pierwotnych z w pełni zoptymalizowanymi protokołami oraz nowym technikom analitycznym, które wymagają mniejszego nakładu pracy.

Przejście od hodowli komórkowej dwuwymiarowej do trójwymiarowej uznaje się za ważny kamień milowy w tej dziedzinie. W hodowli 2D architektura specyficzna dla danej tkanki, interakcje międzykomórkowe oraz sygnalizacja mechaniczna i biochemiczna mogą być osłabione. W związku z tym wartość biologiczna tych hodowli ma swoje ograniczenia.

Z drugiej strony trójwymiarowa hodowla komórkowa umożliwia komórkom namnażanie się i oddziaływanie z trójwymiarową strukturą pozakomórkową. Dzięki temu komórki mogą wchodzić w interakcje zarówno między sobą, jak i z macierzą pozakomórkową, co sprawia, że hodowle trójwymiarowe są bardziej adekwatne fizjologicznie. Dokładność tej metody w przewidywaniu reakcji in vivo sprawiła, że stała się ona rewolucyjna w takich dziedzinach, jak odkrywanie i opracowywanie leków. Z tego powodu najnowocześniejsze technologie, takie jak organoidy pochodzące od pacjentów oraz „narządy na chipie”, zapewniają wysoce kontekstowe modele do badań przesiewowych i opracowywania leków.

Wytwarzanie komórek pierwotnych stanowi wąskie gardło w hodowli pierwotnej. Aby to przezwyciężyć, zazwyczaj potrzebna jest większa objętość tkanki, co może być trudne do osiągnięcia. Jednak poprawa czułości analitycznej otwiera nowe możliwości. Na przykład zapotrzebowanie na hodowlę dużych ilości komórek pierwotnych zmniejsza się dzięki zastosowaniu technologii pojedynczych komórek, która obejmuje sekwencjonowanie, western blotting i cytometrię masową.

Obiecujące perspektywy dla hodowli komórek pierwotnych

Ogólne trudności związane z hodowlą komórek pierwotnych są łagodzone dzięki postępowi technologicznemu. To z kolei sprawia, że metoda ta szybko zastępuje inne jako złoty standard w badaniach i praktyce z zakresu biologii komórkowej i molekularnej. Produkcja szczepionek, przeszczepy narządów, terapie komórkami macierzystymi, badania nad rakiem i wiele innych dziedzin odniosą ogromne korzyści dzięki ciągłemu postępowi w dziedzinie hodowli komórek pierwotnych.

Wskazówki i triki dotyczące hodowli komórek pierwotnych

Potrzeby związane z namnażaniem komórek

Dwie najpopularniejsze metody hodowli komórek pierwotnych to hodowla w zawiesinie lub na powierzchni (2D). Niektóre komórki są w stanie swobodnie unosić się w krwiobiegu, nie przylegając nigdy do powierzchni (na przykład komórki pochodzące z krwi obwodowej). Stworzono różne linie komórkowe przystosowane do rozwoju w hodowlach zawiesinowych, gdzie mogą osiągać gęstości nieosiągalne w warunkach wzrostu 2D. Komórki pierwotne, które do wzrostu in vitro potrzebują przylegania do podłoża, nazywane są komórkami przylegającymi i obejmują komórki występujące w tkankach litych. Aby poprawić właściwości adhezyjne i zapewnić dostarczanie innych sygnałów niezbędnych do wzrostu i różnicowania, komórki te są zazwyczaj hodowane w płaskich, niepowlekanych naczyniach z tworzywa sztucznego, ale czasami również na mikronosiaczach. Te ostatnie mogą być powlekane białkami macierzy pozakomórkowej (takimi jak kolagen i laminina). Pożywka stosowana w hodowli komórkowej składa się z pożywki podstawowej, która została uzupełniona odpowiednimi czynnikami wzrostu i cytokinami. Inkubator komórkowy to specjalny rodzaj inkubatora laboratoryjnego służący do hodowli i utrzymywania komórek w określonej temperaturze i mieszaninie gazów (zazwyczaj 37 °C, 5% CO₂ w przypadku komórek ssaków). W zależności od rodzaju hodowanych komórek optymalne warunki mogą się znacznie różnić. W zależności od rodzaju hodowanych komórek optymalna pożywka wzrostowa będzie miała unikalną kombinację czynników, w tym między innymi pH, stężenie glukozy, czynniki wzrostu oraz obecność innych składników odżywczych.

Obecność antybiotyków w pożywce wzrostowej ma kluczowe znaczenie podczas zakładania hodowli pierwotnej, aby zapobiec zakażeniu pochodzącemu z tkanki gospodarza. Niektóre schematy antybiotykowe obejmują połączenie gentamycyny, penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B. Nie zaleca się jednak stosowania antybiotyków przez dłuższy czas, ponieważ niektóre substancje (takie jak amfoterycyna B) mogą w dłuższej perspektywie być toksyczne dla komórek.

Większość komórek pierwotnych przechodzi proces starzenia się i przestaje się dzielić po określonej liczbie podwojeń populacji, dlatego kluczowe znaczenie ma utrzymanie ich przy życiu po izolacji. Długotrwała żywotność komórek wymaga specjalistycznych technik hodowli komórkowej oraz idealnych warunków hodowli (w tym odpowiedniej pożywki, odpowiedniej temperatury, odpowiedniej mieszanki gazowej, odpowiedniego pH, odpowiedniego stężenia czynników wzrostu, obecności składników odżywczych oraz obecności glukozy). Ponieważ wiele czynników wzrostu stosowanych jako dodatki do pożywek pozyskuje się z krwi zwierzęcej (składniki pochodzenia krwiopochodnego niosą ze sobą ryzyko zanieczyszczenia), zaleca się ograniczenie ich stosowania do minimum lub całkowite unikanie ich stosowania. Ważne jest również stosowanie technik aseptycznych.

Subkultury i utrzymywanie hodowli

Gdy izolowane komórki przylegają do powierzchni naczynia hodowlanego, oznacza to początek fazy utrzymania. Przyleganie następuje zazwyczaj 24 godziny po rozpoczęciu hodowli. Komórki należy poddawać subkulturze, gdy osiągną określony procent konfluencji i będą aktywnie się namnażać. Ponieważ komórki po osiągnięciu konfluencji mogą ulegać różnicowaniu i wykazywać wolniejsze namnażanie po pasażowaniu, najlepiej jest przeprowadzać subkulturę pierwotnych hodowli komórkowych, zanim osiągną one 100% konfluencji.

Przeszczepianie do świeżych pożywek pozwala utrzymać wykładniczy wzrost komórek zależnych od przylegania. Przeszczepianie monowarstw zakłóca międzykomórkowe i wewnątrzkomórkowe interakcje na powierzchni komórek. Do wyodrębniania przylegających komórek pierwotnych z monowarstw lub tkanek stosuje się niskie stężenia enzymów proteolitycznych, takich jak trypsyna/EDTA. Po rozdzieleniu i rozcieńczeniu do postaci roztworu zawierającego pojedyncze komórki, komórki są zliczane i przenoszone do świeżych naczyń hodowlanych w celu ponownego przylegania i namnażania się.

Kriokonserwacja i odtwarzanie

Kriokonserwacja pozwala zachować żywe komórki poprzez zamrażanie ich w niskich temperaturach. Kriokonserwacja i rozmrażanie ludzkich komórek pierwotnych zapobiega śmierci i uszkodzeniom komórek podczas przechowywania i użytkowania. Ludzkie komórki pierwotne są zabezpieczane przed zamarzaniem za pomocą DMSO lub glicerolu (w odpowiedniej temperaturze i przy kontrolowanej szybkości zamrażania). Proces zamrażania musi przebiegać stopniowo, z tempem -1 °C na minutę, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu. Długoterminowe przechowywanie wymaga użycia ciekłego azotu (-196 °C) lub temperatur poniżej -130 °C.

Aby rozmrozić komórki poddane kriokonserwacji, wystarczy zanurzyć zamrożone komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na około 1–2 minuty. Komórek pierwotnych pochodzenia ludzkiego nie należy odwirowywać po wyjęciu z zamrażarki (ponieważ są one niezwykle wrażliwe na uszkodzenia podczas odzyskiwania po kriokonserwacji). Nadaje się do wysiewania komórek bezpośrednio po rozmrożeniu i wspomaga przyleganie w hodowlach w ciągu pierwszych 24 godzin po wysiewie. 1 Po przyleganiu kriokonserwowanych komórek pierwotnych należy usunąć zużyte pożywki (ponieważ DMSO jest szkodliwe dla komórek pierwotnych i może powodować spadek żywotności po rozmrożeniu).