Bioprinting z wykorzystaniem linii komórkowych: Od 2D do 3D drukowanych struktur tkankowych

Trójwymiarowy druk biologiczny stanowi rewolucyjną technologię, która umożliwia precyzyjne przestrzenne osadzanie żywych komórek, biomateriałów i bioaktywnych cząsteczek w celu wytworzenia konstruktów tkankowych o określonej architekturze, które odtwarzają natywną organizację tkanek. W Cytion zdajemy sobie sprawę, że ustalone linie komórkowe oferują znaczące korzyści w zastosowaniach biodruku w porównaniu z komórkami pierwotnymi, w tym nieograniczoną zdolność do ekspansji, dobrze scharakteryzowane zachowanie, stałą jakość i mniejsze ograniczenia etyczne. Przejście od tradycyjnej dwuwymiarowej hodowli jednowarstwowej do trójwymiarowych konstruktów biodrukowanych z wykorzystaniem komórek i linii komórkowych wymaga starannego rozważenia składu bioutwardzacza, metodologii drukowania, odpowiedzi komórek na naprężenia mechaniczne podczas osadzania oraz protokołów dojrzewania po wydrukowaniu. To zaawansowane podejście produkcyjne umożliwia wytwarzanie złożonych modeli tkankowych do badań przesiewowych leków, modelowania chorób i podstawowych badań biologicznych z niespotykaną dotąd kontrolą nad składem komórkowym, organizacją przestrzenną i cechami mikroarchitektonicznymi.

Formuła i właściwości reologiczne biokomponentów

Formuła biotuszu stanowi najbardziej krytyczny czynnik decydujący o powodzeniu biodruku, wymagający starannej równowagi między charakterystyką drukowalności, kompatybilnością komórek i integralnością strukturalną po wydrukowaniu. Idealne biotusze wykazują właściwości rozrzedzania ścinaniem, z lepkością zmniejszającą się pod wpływem naprężenia ścinającego podczas wytłaczania, a następnie szybko powracającą po osadzeniu, aby zachować wierność wydrukowanej struktury. Lepkość zazwyczaj waha się od 30 do 6×10⁷ mPa-s w zależności od metodologii drukowania, przy czym systemy oparte na wytłaczaniu wymagają wyższej lepkości (≥1000 mPa-s) w celu zachowania kształtu w porównaniu z metodami atramentowymi, które wymagają niskiej lepkości (3-12 mPa-s) do tworzenia kropli. Stężenie komórek w biotuszach zazwyczaj waha się od 1×10⁶ do 2×10⁷ komórek na mililitr, równoważąc wystarczającą gęstość komórek do tworzenia tkanek z potencjalnym zatykaniem dysz drukujących i nadmierną lepkością materiału. Typowe materiały bazowe bio-ink obejmują alginian, żelatynę, metakrylan żelatyny (GelMA), kwas hialuronowy i agarozę, często łączone w wieloskładnikowe preparaty w celu optymalizacji właściwości mechanicznych, kinetyki degradacji i aktywności biologicznej. W przypadku komórek i linii komórkowych Cytion, empiryczna optymalizacja składu biokomponentu jest niezbędna, aby uwzględnić specyficzne dla danego typu komórek wymagania dotyczące adhezji i wrażliwości na naprężenia mechaniczne podczas drukowania.

Systemy biodruku oparte na wytłaczaniu

Bioprinting oparty na ekstruzji jest najczęściej stosowaną technologią ze względu na stosunkowo niskie koszty sprzętu, kompatybilność z biokomponentami o wysokiej lepkości i wysokiej gęstości komórek oraz skalowalność do wytwarzania konstrukcji w skali centymetrowej. Systemy te dozują ciągłe włókna materiału wypełnionego komórkami przez cylindryczne dysze o średnicy od 100 do 500 mikrometrów, z osadzaniem kontrolowanym przez ciśnienie pneumatyczne, mechaniczne przemieszczanie śrubowe lub uruchamianie tłokowe. Naprężenie ścinające doświadczane przez komórki podczas wytłaczania w dyszy stanowi główny problem, a jego wielkość zależy od średnicy dyszy, zastosowanego ciśnienia i lepkości biokomponentu zgodnie z zasadami mechaniki płynów. Komórki doświadczają szczytowego naprężenia ścinającego na ściance dyszy, potencjalnie powodując uszkodzenie błony, zmniejszoną żywotność i zmienione profile ekspresji genów, jeśli są nadmierne. Optymalizacja wymaga zrównoważenia średnicy dyszy i ciśnienia wytłaczania w celu osiągnięcia pożądanej rozdzielczości przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności komórek zazwyczaj powyżej 80%. Możliwości wielomateriałowego biodruku umożliwiają jednoczesne lub sekwencyjne osadzanie różnych typów komórek i materiałów, ułatwiając wytwarzanie heterogenicznych konstruktów tkankowych o przestrzennie zdefiniowanym składzie. Konfiguracje dysz współosiowych pozwalają na bezpośrednie drukowanie pustych struktur rurowych przydatnych do unaczynienia, z materiałem rdzenia następnie usuwanym w celu utworzenia opatentowanych prześwitów wyłożonych komórkami śródbłonka.

Biodruk atramentowy i kropelkowy

Technologie biodruku atramentowego zaadaptowane z komercyjnych systemów drukowania dokumentów umożliwiają precyzyjne osadzanie kropel zawierających komórki o objętości pikolitra, oferując wysoką rozdzielczość wzornictwa przestrzennego i szybkie prędkości drukowania odpowiednie do zastosowań o wysokiej przepustowości. Termiczne systemy atramentowe generują pęcherzyki pary poprzez rezystancyjne elementy grzewcze, tworząc impulsy ciśnienia, które wyrzucają kropelki z głowicy drukującej, podczas gdy systemy piezoelektryczne wykorzystują indukowane napięciem odkształcenie kryształów piezoelektrycznych do generowania fal akustycznych, które napędzają kropelki. Obawy o żywotność komórek początkowo ograniczały przyjęcie termicznych metod atramentowych ze względu na przejściowe wzrosty temperatury, ale zoptymalizowane systemy wykazują minimalne uszkodzenia termiczne przy temperaturach utrzymywanych poniżej krytycznych progów i czasach ekspozycji ograniczonych do mikrosekund. Systemy piezoelektryczne unikają naprężeń termicznych, ale wymagają starannego dostrojenia parametrów akustycznych, aby zrównoważyć niezawodność tworzenia kropli z naprężeniami mechanicznymi komórek. Lepkość bio-tuszu w systemach atramentowych musi pozostać poniżej około 12 mPa-s, aby umożliwić tworzenie kropli, co ogranicza opcje materiałowe w porównaniu z metodami opartymi na wytłaczaniu i zazwyczaj wymaga sieciowania po osadzeniu w celu uzyskania stabilności strukturalnej. Wysoka precyzja i wydajność biodruku atramentowego sprawiają, że jest on szczególnie odpowiedni do zastosowań wymagających zdefiniowanych wzorów przestrzennych wielu typów komórek, takich jak modele współhodowli lub generowanie gradientu do badań przesiewowych leków przy użyciu komórek HeLa i innych ustalonych linii komórkowych.

Bioprinting wspomagany laserowo i modelowanie w wysokiej rozdzielczości

Biodrukowanie wspomagane laserem (LAB), określane również jako laserowy transfer do przodu, osiąga najwyższą rozdzielczość przestrzenną wśród technologii biodrukowania, umożliwiając osadzanie pojedynczych komórek lub małych grup komórek z precyzją w skali mikrometrów. System LAB składa się z impulsowego źródła lasera, szkiełka donorowego pokrytego materiałem pochłaniającym energię i biotuszem zawierającym komórki oraz podłoża odbiorczego umieszczonego w bliskiej odległości pod szkiełkiem donorowym. Zogniskowane impulsy laserowe odparowują warstwę pochłaniającą energię, generując pęcherzyki wysokociśnieniowe, które napędzają kropelki zawierające komórki ze szkiełka donorowego na podłoże odbiorcze z precyzyjną kontrolą przestrzenną. Rozdzielczość 10-50 mikrometrów i żywotność komórek przekraczającą 95% można osiągnąć przy zoptymalizowanych parametrach, znacznie przewyższając inne metody biodruku. Bezdyszowy charakter LAB eliminuje naprężenia ścinające związane z wytłaczaniem i zapobiega zatykaniu się systemów opartych na dyszach podczas drukowania zawiesin komórek o wysokiej lepkości lub gęstości. Systemy LAB wymagają jednak zaawansowanego sprzętu optycznego i starannej optymalizacji parametrów lasera, w tym długości fali, czasu trwania impulsu, gęstości energii i rozmiaru ogniska, aby zrównoważyć niezawodność drukowania z żywotnością komórek. Zdolność do drukowania komórek z rozdzielczością pojedynczej komórki sprawia, że LAB jest szczególnie cenny w zastosowaniach wymagających precyzyjnej organizacji przestrzennej, takich jak ko-kultury neuron-glej lub badanie sygnalizacji komórka-komórka na określonych odległościach.

Stereolitografia i cyfrowe przetwarzanie światła

Stereolitografia (SLA) i cyfrowe przetwarzanie światła (DLP) wykorzystują fotopolimeryzację warstwa po warstwie fotosieciowalnych hydrożeli obciążonych komórkami do szybkiego wytwarzania złożonych trójwymiarowych geometrii z rozdzielczością 25-100 mikrometrów. W przeciwieństwie do metod opartych na osadzaniu, które budują struktury poprzez sekwencyjne umieszczanie materiałów, metody oparte na świetle sieciują całe warstwy jednocześnie, znacznie skracając czas wytwarzania złożonych geometrii. Systemy DLP wyświetlają wzory świetlne odpowiadające przekrojom całych warstw za pomocą cyfrowych matryc mikroluster, podczas gdy systemy SLA skanują skupione wiązki laserowe w celu śledzenia wzorów warstw, przy czym DLP generalnie oferuje szybsze drukowanie. Biotusze fotosieciujące zawierają fotoinicjatory, które generują reaktywne formy po ekspozycji na światło, wyzwalając polimeryzację lub sieciowanie prekursorów hydrożelu, takich jak metakrylan żelatyny, diakrylan glikolu polietylenowego lub metakrylan kwasu hialuronowego. Żywotność komórek zależy w dużej mierze od stężenia fotoinicjatora, intensywności światła i czasu ekspozycji, ponieważ reaktywne formy tlenu generowane podczas fotoinicjacji mogą uszkadzać składniki komórkowe. Zoptymalizowane systemy osiągają 75-95% żywotności po wydrukowaniu dzięki zastosowaniu kompatybilnych z komórkami fotoinicjatorów światła widzialnego (fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu), niskich stężeń fotoinicjatora (0,05-0,5%) i zminimalizowanej ekspozycji na światło. Zdolność do szybkiego wytwarzania złożonych sieci naczyniowych i skomplikowanych architektur tkankowych sprawia, że SLA/DLP jest szczególnie obiecująca dla zastosowań organ-on-chip i inżynierii tkankowej, choć wymaga kompatybilnych materiałów fotosieciujących i starannego zarządzania kinetyką fotopolimeryzacji.

Dojrzewanie po wydruku i optymalizacja hodowli

Konstrukty drukowane biologicznie bezpośrednio po wytworzeniu zazwyczaj wykazują ograniczone interakcje komórka-komórka, minimalne osadzanie macierzy pozakomórkowej i właściwości mechaniczne zdominowane przez materiał biokomponentu, a nie charakterystykę tkanki biologicznej. Hodowla dojrzewająca po wydruku jest niezbędna, aby umożliwić rozprzestrzenianie się komórek z ich początkowo kulistej morfologii, ustanowienie połączeń komórka-komórka, wydzielanie i organizację endogennej macierzy zewnątrzkomórkowej oraz rozwój funkcji specyficznych dla tkanki. Wymagania dotyczące czasu trwania hodowli wahają się od dni do tygodni, w zależności od typu komórek, złożoności konstrukcji i zamierzonego zastosowania, przy czym komórki aktywne metabolicznie zazwyczaj wymagają częstszej wymiany pożywki, aby zapobiec wyczerpywaniu się składników odżywczych i gromadzeniu się metabolitów. Suplementacja pożywki do hodowli komórkowej specyficznymi dla tkanki czynnikami wzrostu, hormonami i innymi bioaktywnymi cząsteczkami może przyspieszyć dojrzewanie i poprawić właściwości funkcjonalne, choć konkretne wymagania zależą od typu komórek i pożądanego fenotypu. Stymulacja mechaniczna poprzez przepływ perfuzyjny, cykliczne rozciąganie lub ściskanie promuje dojrzewanie tkanek i rozwój funkcjonalny dla typów komórek wrażliwych na mechanizmy, naśladując fizjologiczne warunki obciążenia. W przypadku biotuszów zawierających biodegradowalne składniki, czasowa ewolucja właściwości mechanicznych odzwierciedla zarówno degradację macierzy, jak i akumulację macierzy wydzielanej przez komórki, co wymaga starannej równowagi między kinetyką degradacji a szybkością odkładania się macierzy. Monitorowanie dojrzewania poprzez ocenę morfologiczną, analizę ekspresji genów i testy funkcjonalne umożliwia optymalizację warunków hodowli i określenie odpowiednich punktów czasowych do eksperymentalnego badania biodrukowanych modeli tkanek.

Zastosowania w badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób

Biodrukowane konstrukty tkankowe wykorzystujące ustalone linie komórkowe z katalogu Cytion oferują potężne platformy do badań przesiewowych związków farmaceutycznych i modelowania chorób o lepszym znaczeniu fizjologicznym w porównaniu z tradycyjnymi hodowlami dwuwymiarowymi. Zdolność do precyzyjnej kontroli składu komórkowego, organizacji przestrzennej i cech mikroarchitektonicznych umożliwia systematyczne badanie zależności struktura-funkcja i generowanie powtarzalnych modeli tkankowych odpowiednich do wysokowydajnych badań przesiewowych. Modele nowotworowe drukowane biologicznie z liniami komórek nowotworowych, fibroblastami zrębu i komórkami śródbłonka w określonych układach przestrzennych lepiej odwzorowują cechy mikrośrodowiska guza, w tym gradienty niedotlenienia, niejednorodną penetrację leków i interakcje zrębu z guzem, które wpływają na odpowiedź terapeutyczną. Modele tkanek wątroby zawierające linie komórkowe hepatocytów w określonych architekturach wykazują zwiększoną ekspresję cytochromu P450 i funkcje metaboliczne w porównaniu z konwencjonalnymi kulturami, poprawiając dokładność predykcyjną badań przesiewowych hepatotoksyczności. Biodrukowane modele tkanki nerwowej z precyzyjną organizacją neuronów i gleju umożliwiają badanie mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych i badanie przesiewowe związków neuroprotekcyjnych. Zalety biodruku w zakresie odtwarzalności w porównaniu z ręcznie generowanymi trójwymiarowymi kulturami ułatwiają standaryzację niezbędną do akceptacji regulacyjnej i integracji z farmaceutycznymi rurociągami rozwojowymi, chociaż walidacja w stosunku do wyników in vivo pozostaje niezbędna do ustalenia zaufania do zdolności predykcyjnych.