Hodowla komórek ssaków: Podstawy i techniki
Hodowla komórek ssaków jest podstawową techniką w badaniach biologicznych, umożliwiającą naukowcom badanie komórek w kontrolowanym środowisku poza żywymi organizmami. Proces ten obejmuje izolowanie komórek z tkanek, utrzymywanie ich w starannie kontrolowanych warunkach i rozmnażanie ich do różnych celów eksperymentalnych. Hodowla komórek ssaków ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesów komórkowych, mechanizmów chorobowych i opracowywania nowych terapii, w tym tych wykorzystujących nieśmiertelne linie komórkowe
Kluczowe wnioski:
- Komórki mogą być izolowane z tkanek przy użyciu enzymatycznego trawienia lub metod hodowli eksplantacyjnej
- Pierwotne komórki mają ograniczoną żywotność, podczas gdy unieśmiertelnione linie komórkowe mogą rozmnażać się w nieskończoność
- Warunki hodowli, w tym skład pożywki wzrostowej, mają kluczowe znaczenie dla przeżycia i proliferacji komórek
- Komórki mogą być hodowane w zawiesinie lub jako kultury adherentne, w zależności od ich typu i potrzeb badawczych
- Typowe pożywki hodowlane obejmują MEM, DMEM i RPMI 1640, z których każda jest dostosowana do określonych typów komórek
- Typowe warunki wzrostu obejmują temperaturę 37°C, 5% CO2 i wilgotność względną 95%
- Alternatywy dla surowicy, takie jak lizat ludzkich płytek krwi (hPL), są coraz częściej stosowane w celu uniknięcia potencjalnego zanieczyszczenia
Techniki izolacji komórek
Proces tworzenia hodowli komórkowej rozpoczyna się od izolacji komórek z tkanek. Istnieje kilka metod osiągnięcia tego celu, z których każda jest dostosowana do różnych typów tkanek i celów badawczych. W przypadku próbek krwi izolacja komórek jest stosunkowo prosta, a białe krwinki są głównym celem hodowli ze względu na ich zdolność do wzrostu. Tkanki stałe wymagają bardziej złożonych technik izolacji. Jedna z powszechnych metod obejmuje trawienie enzymatyczne, w którym enzymy takie jak kolagenaza, trypsyna lub pronaza są wykorzystywane do rozbicia macierzy zewnątrzkomórkowej, uwalniając pojedyncze komórki do zawiesiny. Alternatywnie, badacze mogą zastosować metodę hodowli eksplantacyjnej, w której małe kawałki tkanki są umieszczane bezpośrednio w pożywce wzrostowej, umożliwiając komórkom migrację i proliferację. Wybór między tymi metodami często zależy od konkretnego typu tkanki, pożądanej populacji komórek i zamierzonego zastosowania eksperymentalnego. Ważne jest, aby pamiętać, że komórki izolowane bezpośrednio z organizmu są określane jako komórki pierwotne i, z pewnymi wyjątkami, takimi jak komórki nowotworowe, zazwyczaj mają ograniczoną żywotność w hodowli, zanim ulegną starzeniu
Podstawowe produkty do hodowli komórek ssaków
| Nazwa produktu | Numer produktu | Kategoria | Zastosowanie |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/L glukoza, w: 4 mM L-glutamina, w: 1,5 g/L NaHCO3, w: 1,0 mM pirogronian sodu | 820300a | Podłoże hodowlane | Pożywka ogólnego przeznaczenia dla różnych typów komórek ssaków |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L glukozy, w: 1,6 mM L-glutaminy, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM pirogronianu sodu, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Podłoże hodowlane | Odpowiednie dla szerokiego zakresu komórek ssaków, zwłaszcza komórek nabłonkowych |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabilnej glutaminy, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Podłoże hodowlane | Powszechnie stosowane do komórek limfoidalnych i hybrydowych linii komórkowych |
| Accutase | 830100 | Dysocjacja komórek | Delikatny roztwór do odłączania komórek przylegających |
| Medium zamrażające CM-1 | 800150 | Kriokonserwacja | Do zamrażania i długotrwałego przechowywania komórek ssaków |
| Pożywka do zamrażania CM-ACF, bez surowicy | 800650 | Kriokonserwacja | Niezawierająca składników pochodzenia zwierzęcego pożywka do zamrażania komórek |
| PBS | 860015 | Roztwór buforowy | Do płukania komórek i utrzymywania równowagi pH |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka | 820731 | Specjalistyczne podłoże | Zoptymalizowana do hodowli komórek śródbłonka |
| Test na mykoplazmę | 900159 | Kontrola jakości | Niezbędny do wykrywania skażenia mykoplazmą w hodowlach |
| Uwierzytelnianie linii komórkowej - ludzkiej | 900154 | Kontrola jakości | Weryfikuje tożsamość ludzkich linii komórkowych |
Niniejsza tabela przedstawia wybór podstawowych produktów do hodowli komórek ssaków. Aby zapoznać się z naszą pełną ofertą produktów do hodowli komórkowych, w tym specjalistycznych mediów i odczynników, odwiedź naszą stronę kategorii Media i odczynniki.
- delikatna alternatywa dla trypsyny
Accutase to roztwór do odłączania komórek, który rewolucjonizuje przemysł hodowli komórkowych. Jest to mieszanka enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych, która naśladuje działanie trypsyny i kolagenazy. W przeciwieństwie do trypsyny, Accutase nie zawiera żadnych składników pochodzących od ssaków lub bakterii i jest znacznie łagodniejszy dla komórek, co czyni go idealnym rozwiązaniem do rutynowego odłączania komórek od standardowych naczyń plastikowych do hodowli tkankowych i naczyń plastikowych pokrytych powłoką adhezyjną. W tym wpisie na blogu omówimy zalety i zastosowania Accutase oraz sposób, w jaki zmienia ona zasady gry w hodowli komórkowej.
Zalety Accutase
Accutase ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi roztworami trypsyny. Po pierwsze, może być stosowana wszędzie tam, gdzie potrzebne jest delikatne i skuteczne oderwanie dowolnej przylegającej linii komórkowej, co czyni ją bezpośrednim zamiennikiem trypsyny. Po drugie, Accutase działa wyjątkowo dobrze na embrionalnych i neuronalnych komórkach macierzystych i wykazano, że utrzymuje żywotność tych komórek po pasażowaniu. Po trzecie, Accutase zachowuje większość epitopów do późniejszej analizy cytometrii przepływowej, co czyni ją idealną do analizy markerów powierzchniowych komórek.
Dodatkowo, Accutase nie musi być neutralizowana podczas pasażowania przylegających komórek. Dodanie większej ilości pożywki po rozdzieleniu komórek rozcieńcza Accutase tak, że nie jest już w stanie oddzielić komórek. Eliminuje to potrzebę etapu inaktywacji i oszczędza czas techników zajmujących się hodowlą komórek. Wreszcie, Accutase nie musi być dzielona na porcje, a butelka jest stabilna w lodówce przez 2 miesiące.
Zastosowania Accutazy
Accutase jest bezpośrednim zamiennikiem roztworu trypsyny i może być stosowany do pasażowania linii komórkowych. Ponadto, Accutase dobrze sprawdza się podczas odłączania komórek w celu analizy wielu markerów powierzchniowych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i sortowania komórek. Inne zastosowania Accutase obejmują analizę markerów powierzchniowych komórek, test wzrostu wirusa, proliferację komórek, testy migracji komórek nowotworowych, rutynowe pasażowanie komórek, zwiększanie skali produkcji (bioreaktor) i cytometrię przepływową.
Skład Accutazy
Accutase nie zawiera składników pochodzących od ssaków lub bakterii i jest naturalną mieszaniną enzymów o aktywności proteolitycznej i kolagenolitycznej. Jest formułowany w znacznie niższym stężeniu niż trypsyna i kolagenaza, dzięki czemu jest mniej toksyczny i łagodniejszy, ale równie skuteczny.
Skuteczność Accutase
Wykazano, że Accutase jest skuteczny w odłączaniu komórek pierwotnych i macierzystych oraz utrzymuje wysoką żywotność komórek w porównaniu z enzymami pochodzenia zwierzęcego, takimi jak trypsyna. 100% komórek jest odzyskiwanych po 10 minutach, a pozostawienie komórek w Accutase do 45 minut nie jest szkodliwe, dzięki automatycznemu trawieniu Accutase.
Podsumowanie
Podsumowując, Accutase to potężne rozwiązanie, które zmienia zasady gry w hodowli komórkowej. Dzięki swojej łagodności, wydajności i wszechstronności, Accutase jest idealną alternatywą dla trypsyny. Jeśli szukasz niezawodnego i wydajnego rozwiązania do odłączania komórek, Accutase jest rozwiązaniem dla Ciebie.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) jest szeroko stosowanym roztworem buforowym w badaniach biologicznych i chemicznych. Odgrywa kluczową rolę w utrzymywaniu równowagi pH i osmolarności podczas różnych procedur eksperymentalnych, w tym przetwarzania tkanek i hodowli komórkowej. Nasz roztwór PBS jest starannie opracowany ze składników o wysokiej czystości, aby zapewnić stabilność i niezawodność w każdym eksperymencie. Osmolarność i stężenia jonów naszego PBS ściśle naśladują te występujące w ludzkim organizmie, dzięki czemu jest on izotoniczny i nietoksyczny dla większości komórek.
Skład naszego roztworu PBS
Nasz roztwór PBS to dostosowana pod względem pH mieszanka ultraczystych buforów fosforanowych i roztworów soli fizjologicznej. W stężeniu roboczym 1X zawiera:
8000 mg/l chlorku sodu (NaCl)
200 mg/l chlorku potasu (KCl)
1150 mg/L Bezwodny dwuzasadowy fosforan sodu (Na2HPO4)
200 mg/L Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny (KH2PO4)
Taki skład zapewnia optymalne pH i równowagę jonową, odpowiednie do szerokiego zakresu zastosowań biologicznych.
Zastosowania naszego roztworu PBS
Nasz roztwór PBS jest idealny do różnych zastosowań w badaniach biologicznych. Jego izotoniczne i nietoksyczne właściwości sprawiają, że nadaje się do rozcieńczania substancji i płukania pojemników z komórkami. Roztwory PBS zawierające EDTA są skuteczne w odłączaniu przyczepionych i zbrylonych komórek. Do PBS nie należy jednak dodawać metali dwuwartościowych, takich jak cynk, ponieważ może to spowodować wytrącanie się osadów. W takich przypadkach zalecane są bufory Good's. Ponadto nasz roztwór PBS jest akceptowalną alternatywą dla wirusowego podłoża transportowego do transportu i przechowywania wirusów RNA, w tym SARS-CoV-2.
Kontrola jakości
Sterylnie filtrowany
Przechowywanie i okres trwałości
Przechowywać w temperaturze od +2°C do +25°C, chronić przed światłem.
Po otwarciu przechowywać w temperaturze od 2°C do 25°C i zużyć w ciągu 24 miesięcy.
Warunki wysyłki
Temperatura otoczenia
Konserwacja
Przechowywać w lodówce w temperaturze od +2°C do +8°C w ciemności. Unikać zamrażania i częstego podgrzewania do temperatury +37°C, ponieważ obniża to jakość produktu.
Nie podgrzewać nośnika powyżej 37°C ani nie używać niekontrolowanych źródeł ciepła, takich jak urządzenia mikrofalowe.
Jeśli ma być użyta tylko część pożywki, należy usunąć wymaganą ilość i ogrzać ją do temperatury pokojowej przed użyciem.
Skład
Kategoria
Składniki
Stężenie (mg/L)
Sole
Chlorek potasu
200
Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny
200
Chlorek sodu
8000
Bezwodny dwuzasadowy fosforan sodu
1150
Metoda analizy
CLS oferuje zarówno krótkoterminowe, jak i długoterminowe testy do wykrywania mykoplazmy. W pierwszym przypadku próbki są badane natychmiast po dostarczeniu, podczas gdy w drugim przypadku rozpoczyna się hodowlę komórkową, a komórki są badane po 14 dniach hodowli bez antybiotyków. Testy na obecność mykoplazmy są przeprowadzane przy użyciu dwupunktowego systemu wykrywania zarówno PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen), jak i Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Próbki
Do szybkiego testu należy dostarczyć co najmniej 50 µl zawiesiny komórkowej zawierającej 50 000 komórek. Zawiesina komórek może być dostarczona w temperaturze otoczenia.
W przypadku testu premium należy dostarczyć co najmniej 1 milion komórek w odpowiedniej pożywce do zamrażania, aby zapewnić solidną i zdrową kulturę do hodowli i późniejszego testowania komórek. Próbki należy wysłać w suchym lodzie.
Prosimy o wypełnienie Formularza Próbki do Badania Mykoplazmy i dołączenie go do przesyłki z próbką.
Kolorymetryczny test reporterowy
Ten test jest testem kolorymetrycznym opartym na komórkach. W obecności mykoplazmy, reporterowa linia komórkowa indukuje kaskadę sygnalizacyjną wyzwalającą zmianę koloru pożywki z czerwonego na niebieski. Test jest przeprowadzany na 96-dołkowych płytkach wielodołkowych. Sygnały są wykrywane w spektrofotometrze mikropłytkowym przy długości fali 620-655 nm. Wykrywane są wszystkie gatunki mykoplazmy i acholeplazmy, ale także inne zanieczyszczenia w hodowli komórkowej, takie jak bakterie.
Amplifikacja izotermiczna
Amplifikacja izotermiczna jest szybkim i niezawodnym testem opartym na izotermicznej amplifikacji DNA specyficznego dla mykoplazmy w połączeniu z wykrywaniem w czasie rzeczywistym przy użyciu barwnika interkalującego DNA. Test jest w stanie wykryć sześć najbardziej powszechnych gatunków, które stanowią >95% zanieczyszczeń: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis i A.laidlawii. Ze względu na homologię sekwencji wykryte zostaną również inne gatunki mykoplazmy (M.pneumoniae, M.gallisepticum i M.synoviae). Aby określić, czy próbka jest mykoplazmą pozytywną czy negatywną, badana jest temperatura topnienia (Tm).
Wnioski: Kluczowa rola hodowli komórek ssaków we współczesnych badaniach naukowych
Hodowla komórek ssaków zrewolucjonizowała badania biologiczne i medyczne, zapewniając naukowcom potężne narzędzia do badania złożonych procesów komórkowych, mechanizmów chorobowych i potencjalnych interwencji terapeutycznych. Od izolacji komórek pierwotnych po rozwój unieśmiertelnionych linii komórkowych, technika ta stała się nieodzowną częścią nowoczesnego zestawu narzędzi naukowych
Hodowla komórek ssaków rozpoczyna się od starannych technik izolacji, przechodzi przez skrupulatną konserwację komórek w specjalistycznych pożywkach i kończy się szerokim wachlarzem zastosowań w różnych dziedzinach badań. Niezależnie od tego, czy chodzi o badania nad rakiem, odkrywanie leków czy podstawową biologię komórkową, zdolność do hodowania i manipulowania komórkami ssaków in vitro otworzyła bezprecedensowe możliwości badań naukowych
Kluczem do sukcesu hodowli komórek ssaków są starannie kontrolowane warunki, w których komórki są utrzymywane. Od składu pożywki wzrostowej po precyzyjne parametry środowiskowe w inkubatorach, każdy aspekt jest zoptymalizowany tak, aby jak najdokładniej naśladować naturalne warunki komórek. Ta dbałość o szczegóły zapewnia niezawodność i powtarzalność eksperymentów, co jest kamieniem węgielnym dobrej praktyki naukowej
Rozwój unieśmiertelnionych linii komórkowych, takich jak szeroko stosowane komórki HeLa, jeszcze bardziej rozszerzył możliwości hodowli komórkowej. Te linie komórkowe zapewniają spójne, łatwo dostępne modele komórkowe, które przyspieszyły badania w wielu dyscyplinach
Patrząc w przyszłość, hodowla komórek ssaków nadal ewoluuje. Postępy w technikach hodowli 3D, rozwój organoidów i wykorzystanie chemicznie zdefiniowanych mediów przesuwają granice tego, co jest możliwe w hodowli komórkowej. Rozwój ten obiecuje jeszcze bardziej zbliżyć modele in vitro do złożoności systemów in vivo, potencjalnie rewolucjonizując odkrywanie leków, spersonalizowaną medycynę i nasze zrozumienie biologii człowieka
Podsumowując, hodowla komórek ssaków pozostaje dynamiczną i istotną techniką w badaniach nauk przyrodniczych. Jej ciągłe udoskonalanie i stosowanie niewątpliwie odegra kluczową rolę w rozwiązywaniu niektórych z najbardziej palących pytań w biologii i medycynie, napędzając postęp naukowy w nadchodzących latach