Cellule HaCaT - Approfondimento sulla biologia della pelle e sulle patologie cutanee

Caratteristiche genetiche e origine delle cellule HaCaT

Le cellule HaCaT sono una linea cellulare di cheratinociti umani immortalizzati spontaneamente, originata dalla pelle adulta e che rappresenta un percorso evolutivo unico. Queste cellule presentano mutazioni in entrambi gli alleli del gene p53, il che è tipico delle mutazioni indotte dalle radiazioni UV [3,4]. Inoltre, si presume che le cellule HaCaT siano state generate da mutazioni del gene oncosoppressore p53, seguite dalla perdita dei geni della senescenza [5].

Il gene oncosoppressore p53, noto per il suo ruolo nella riparazione del DNA e come guardiano del genoma, induce la risposta della pelle umana al danno al DNA [4]. È stato osservato che le cellule HaCaT hanno parzialmente perso il loro meccanismo di protezione contro il danno al DNA a causa della mutazione in vivo del gene p53, rendendole suscettibili all'accumulo di cambiamenti citogenetici in risposta a temperature di coltura elevate. Un altro meccanismo di immortalizzazione delle cellule HaCaT comporta un aumento dell'attività dell'enzima telomerasi [7]. Nelle cellule normali, i telomeri si accorciano continuamente ad ogni divisione cellulare fino al raggiungimento della senescenza cellulare. La telomerasi è un complesso enzimatico cellulare specializzato con attività di trascrittasi inversa che mantiene stabile la lunghezza dei telomeri. Al contrario, le cellule HaCaT mostrano un'attività telomerasi significativamente aumentata, con conseguente mantenimento della lunghezza dei telomeri. Queste osservazioni confermano il ruolo della telomerasi nel processo di immortalizzazione delle cellule HaCaT.

Sono state identificate tre traslocazioni cromosomiche specifiche che comportano la perdita di una copia dei bracci cromosomici 3p, 4p e 9p, un guadagno di 9q e la formazione di isocromosomi. La perdita del braccio corto del cromosoma 3p può portare alla perdita dei geni della senescenza e all'immortalizzazione delle cellule HaCaT [8]. Le cellule HaCaT sono ipodiploidi e possiedono cromosomi marcatori distinti e stabili che rappresentano la loro origine monoclonale. Le caratteristiche e l'origine della linea cellulare HaCaT sono state confermate utilizzando l'impronta genetica con marcatori minisatelliti ipervariabili [3-6].

Come raccogliere le cellule HaCaT in 5 semplici passaggi

4. Rimuovere il terreno di coltura e risciacquare le cellule aderenti utilizzando 3-5 mL di PBS senza calcio e magnesio per le fiasche T25 o 5-10 mL per le fiasche T75.
5. Aggiungere 1-2 mL di soluzione di EDTA allo 0,05% appena preparata per ogni fiasca T25, o 2,5 mL per ogni fiasca T75, assicurandosi che l'intero strato cellulare sia coperto, e incubare a 37 °C per 10 minuti.
6. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA (0,05%/0,025%) appena preparata per ogni fiasca T25, o 2,5 mL per ogni fiasca T75, assicurandosi nuovamente della copertura completa del foglio cellulare. Le cellule dovrebbero staccarsi entro 1-2 minuti.
7. Interrompere l'attività della tripsina aggiungendo un terreno di coltura cellulare contenente FBS.
8. Distribuire le cellule in nuove fiasche contenenti terreno di coltura cellulare fresco.

Applicazioni delle cellule HaCaT

Le cellule HaCaT sono uno strumento prezioso per lo studio dei cheratinociti [9]. Queste cellule immortali funzionano come cellule preneoplastiche e possono fornire informazioni sui cambiamenti coinvolti nella trasformazione maligna e neoplastica [10]. Le colture di cellule HaCaT in monostrato sono essenziali per le applicazioni di analisi della tossicità cellulare e della guarigione delle ferite in vitro. Le cellule HaCaT possono anche essere utilizzate per valutare la tossicità cutanea causata da vari agenti e processi neoplastici o infiammatori. Possono essere utilizzate per analizzare diversi meccanismi di reazioni allergiche cutanee, gli effetti delle specie reattive dell'ossigeno e l'irradiazione con raggi UV. Una volta stimolate, le cellule HaCaT possono differenziarsi ed esprimere marcatori di differenziazione specifici, come l'involucrina, K14 e K10. Le cellule HaCaT sono anche comunemente utilizzate come modello per lo studio della fisiopatologia dell'omeostasi epidermica [6].

Video in primo piano: Alla scoperta del mondo delle cellule HaCaT

"Migrazione delle cellule HaCaT": questo video mostra il processo di migrazione delle cellule HaCaT. La migrazione cellulare è un processo essenziale per vari processi biologici, come la guarigione delle ferite e le metastasi tumorali. Il video mostra il movimento delle cellule HaCaT al microscopio, fornendo una rappresentazione visiva di come queste cellule migrano. L'attività delle cellule viene osservata mentre si spostano da un punto all'altro e il video fornisce una chiara illustrazione dei cambiamenti che si verificano nelle cellule durante questo processo.

"Test dello scratch eseguito su cellule HaCaT": questo video mostra un test dello scratch eseguito su cellule HaCaT. Lo Scratch Assay è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la migrazione cellulare e, in questo caso, viene impiegata per analizzare la migrazione delle cellule HaCaT. Il video mostra il processo di creazione di un graffio sulla superficie di una piastra di coltura cellulare, che viene poi osservato al microscopio mentre le cellule HaCaT migrano e chiudono lo spazio nel corso del tempo.

"Crescita cellulare dei cheratinociti HaCaT per esperimenti di guarigione delle ferite": Questo video mostra il processo di crescita cellulare dei cheratinociti HaCaT per esperimenti di guarigione delle ferite. I cheratinociti HaCaT sono una linea cellulare comunemente utilizzata negli studi sulla guarigione delle ferite.

"Differenziazione delle cellule HaCaT": questo video illustra i passaggi necessari per differenziare le cellule HaCaT. Le cellule HaCaT possono differenziarsi in diversi tipi di cellule cutanee. Il video mostra i cambiamenti nelle cellule HaCaT man mano che si differenziano, rappresentando visivamente i vari marcatori e le caratteristiche della differenziazione. Il processo di differenziazione è fondamentale per il normale funzionamento della pelle e il video evidenzia le diverse fasi di differenziazione che le cellule HaCaT subiscono.

Riferimenti

1. Angel P e Karin M: Il ruolo di Jun, Fos e del complesso AP-1 nella proliferazione e trasformazione cellulare. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: La regolazione della crescita iperplastica epidermica. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolamento e caratterizzazione di una linea di cheratinociti umani a lunga vita insorta spontaneamente (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: Mutazioni del p53 in linee cellulari epiteliali umane immortalizzate. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Punti caldi di mutazione dovuti alla luce solare nel gene p53 del cancro della pelle non melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Fasi multiple e alterazioni genetiche nell'immortalizzazione, nella trasformazione maligna e nella progressione tumorale dei cheratinociti cutanei umani. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Attività della telomerasi nello strato basale rigenerativo dell'epidermide nella pelle umana e nei cheratinociti cutanei immortali e derivati da carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. Le cellule HaCaT come modello affidabile di differenziazione in vitro per analizzare la risposta infiammatoria/riparativa dei cheratinociti umani. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Cheratinizzazione normale in una linea cellulare di cheratinociti umani aneuploidi immortalizzati spontaneamente. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
9. Gibbs, Graham: Analisi dei dati qualitativi. Il kit di ricerca qualitativa Sage. Londra: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Progettazione della ricerca applicata: una guida pratica. Sage: Londra
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Cheratinizzazione normale in una linea cellulare di cheratinociti umani aneuploidi immortalizzati spontaneamente.  Cell Biol. (1988); 106:761–771.