Cellule HaCaT - Esplorare la biologia e le malattie della pelle

2.caratteristiche genetiche e origine delle cellule HaCaT

Le cellule HaCaT sono una linea cellulare di cheratinociti umani immortalizzati spontaneamente, provenienti dalla pelle adulta e che rappresentano un percorso evolutivo unico. Queste cellule possiedono mutazioni in entrambi gli alleli del gene p53, tipiche delle mutazioni indotte dalle radiazioni UV [3,4]. Inoltre, si presume che le cellule HaCaT siano state generate da mutazioni del gene soppressore del tumore p53, seguite dalla perdita di geni della senescenza [5].

Il gene soppressore tumorale p53, noto per il suo ruolo nella riparazione del DNA e come guardiano del genoma, induce la risposta della pelle umana ai danni al DNA [4]. È stato osservato che le cellule HaCaT hanno perso in parte il loro meccanismo di protezione contro i danni al DNA a causa della mutazione in vivo del gene p53, rendendole suscettibili di accumulare cambiamenti citogenetici in risposta a temperature di coltura elevate. Un altro meccanismo di immortalizzazione delle cellule HaCaT prevede un aumento dell'attività dell'enzima telomerasi [7]. Nelle cellule normali, i telomeri si accorciano continuamente a ogni divisione cellulare fino al raggiungimento della senescenza cellulare. La telomerasi è un complesso enzimatico cellulare specializzato con attività di trascrittasi inversa che mantiene stabile la lunghezza dei telomeri. Al contrario, le cellule HaCaT mostrano un'attività telomerasica significativamente aumentata, con conseguente mantenimento della lunghezza dei telomeri. Queste osservazioni confermano il ruolo della telomerasi nel processo di immortalizzazione delle cellule HaCaT.

Sono state identificate tre traslocazioni cromosomiche specifiche che comportano la perdita di una copia dei bracci cromosomici 3p, 4p e 9p, il guadagno del 9q e la formazione di isocromosomi. La perdita del braccio corto del cromosoma 3p può portare alla perdita dei geni della senescenza e all'immortalizzazione delle cellule HaCaT [8]. Le cellule HaCaT sono ipodiploidi e possiedono cromosomi marcatori distinti e stabili che rappresentano la loro origine monoclonale. Le caratteristiche e la testa della linea cellulare HaCaT sono state confermate utilizzando il DNA fingerprinting con marcatori minisatelliti ipervariabili [3-6].

3.come raccogliere le cellule HaCaT in 5 semplici passaggi

4. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare le cellule aderenti con 3-5 mL di PBS senza calcio e magnesio per le fiasche T25 o 5-10 mL per le fiasche T75.
5. Aggiungere 1-2 mL di soluzione di EDTA allo 0,05% appena preparata per ogni fiasca T25 o 2,5 mL per ogni fiasca T75, assicurandosi che l'intero foglio cellulare sia coperto, e incubare a 37°C per 10 minuti.
6. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA (0,05%/0,025%) appena preparata per matraccio T25 o 2,5 mL per matraccio T75, sempre assicurando la copertura completa del foglio cellulare. Le cellule dovrebbero staccarsi entro 1-2 minuti.
7. Interrompere l'attività della tripsina aggiungendo un terreno di coltura cellulare contenente FBS.
8. Dispensare le cellule in nuove fiasche contenenti terreno di coltura cellulare fresco.

4. Applicazioni delle cellule HaCaT

Le cellule HaCaT sono uno strumento prezioso per lo studio dei cheratinociti [9]. Queste cellule immortali funzionano come cellule preneoplastiche e possono fornire informazioni sui cambiamenti coinvolti nella trasformazione maligna e neoplastica [10]. Le colture monostrato di cellule HaCaT sono essenziali per le applicazioni di analisi della tossicità cellulare e della guarigione delle ferite in vitro. Le cellule HaCaT possono anche essere utilizzate per valutare la tossicità cutanea causata da vari agenti e processi neoplastici o infiammatori. Possono essere utilizzate per analizzare i diversi meccanismi delle reazioni allergiche cutanee, gli effetti delle specie reattive dell'ossigeno e l'irradiazione da UV. Su stimolazione, le cellule HaCaT possono differenziarsi ed esprimere specifici marcatori di differenziazione, come involucrina, K14 e K10. Le cellule HaCaT sono anche comunemente utilizzate come modello per studiare la fisiopatologia dell'omeostasi epidermica [6].

Le cellule HaCaT mantengono la capacità di ricostituire un'epidermide strutturata in vivo dopo il trapianto, risultando in una struttura epidermica stratificata che può passare dallo stato basale a quello differenziato mediante variazioni della concentrazione di calcio nel terreno di coltura. Queste cellule consentono anche la caratterizzazione di diversi processi biologici, come l'uso come sistema modello di vitamina D e il metabolismo nella pelle. Poiché le cellule HaCaT non sono state ingegnerizzate geneticamente, presentano una visione imparziale dell'ampio spettro di eventi genetici iniziali della pelle umana.

5. Video in evidenza: Esplorare il mondo delle cellule HaCaT

"Migrazione delle cellule HaCaT": Questo video illustra il processo di migrazione cellulare nelle cellule HaCaT. La migrazione delle cellule è un processo essenziale per vari processi biologici, come la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro. Il video mostra il movimento delle cellule HaCaT al microscopio, fornendo una rappresentazione visiva di come queste cellule migrano. L'attività delle cellule viene osservata mentre si spostano da una posizione all'altra e il video fornisce una chiara illustrazione dei cambiamenti che avvengono nelle cellule durante questo processo.

"Saggio di graffiatura eseguito su cellule HaCaT": Questo video mostra uno Scratch Assay eseguito su cellule HaCaT. Lo Scratch Assay è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la migrazione cellulare e, in questo caso, viene utilizzato per analizzare la migrazione delle cellule HaCaT. Il video mostra il processo di creazione di un graffio sulla superficie di un piatto di coltura cellulare, che viene poi osservato al microscopio mentre le cellule HaCaT migrano e chiudono lo spazio nel tempo.

"Crescita cellulare di cheratinociti HaCaT per esperimenti di guarigione delle ferite": Questo video mostra il processo di crescita cellulare dei cheratinociti HaCaT per gli esperimenti di guarigione delle ferite. I cheratinociti HaCaT sono una linea cellulare comunemente utilizzata negli studi sulla guarigione delle ferite.

"Differenziazione delle cellule HaCaT": Questo video illustra le fasi necessarie per differenziare le cellule HaCaT. Le cellule HaCaT possono differenziarsi in diversi tipi di cellule della pelle. Il video mostra i cambiamenti delle cellule HaCaT durante la differenziazione, rappresentando visivamente i vari marcatori e le caratteristiche della differenziazione. Il processo di differenziazione è fondamentale per il normale funzionamento della pelle e il video evidenzia le diverse fasi di differenziazione a cui sono sottoposte le cellule HaCaT.

Riferimenti

1. Angel P e Karin M: Il ruolo di Jun, Fos e del complesso AP-1 nella proliferazione e trasformazione cellulare. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolamento e caratterizzazione di una linea spontanea di cheratinociti umani a lunga vita (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: Mutazioni di p53 in linee cellulari epiteliali umane immortalizzate. Carcinogenesi 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Punti caldi di mutazione dovuti alla luce solare nel gene p53 del cancro della pelle non melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Stadi multipli e alterazioni genetiche nell'immortalizzazione, nella trasformazione maligna e nella progressione tumorale dei cheratinociti cutanei umani. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Attività della telomerasi nello strato basale rigenerativo dell'epidermide nella pelle umana e nei cheratinociti immortali e derivati da carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. Le cellule HaCaT come modello di differenziazione in vitro affidabile per sviscerare la risposta infiammatoria/riparativa dei cheratinociti umani. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normale cheratinizzazione in una linea cellulare di cheratinociti umani aneuploidi immortalizzati spontaneamente. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analizzare i dati qualitativi. Il kit per la ricerca qualitativa di Sage. Londra: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Progettazione della ricerca applicata: una guida pratica. Sage: Londra
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normale cheratinizzazione in una linea cellulare di cheratinociti umani aneuploidi immortalizzati spontaneamente. Cell Biol.(1988);106:761-771.