Cellule HEK293: Una pietra miliare nella ricerca cellulare e nella biotecnologia moderna

Le cellule del rene embrionale umano 293(HEK293) sono una linea cellulare del rene embrionale umano che ha guadagnato una vasta popolarità nella comunità scientifica grazie alla loro versatilità e utilità in un'ampia gamma di applicazioni di ricerca. Questa linea cellulare è stata creata all'inizio degli anni '70 e da allora è stata utilizzata per lo sviluppo di vaccini, la ricerca sul cancro, la sperimentazione di farmaci e la trasduzione del segnale. Questo blog post esplorerà tutti gli aspetti della linea cellulare HEK293, compresa la sua origine, le informazioni sulla coltura, i vantaggi e gli svantaggi, le applicazioni e le risorse.

Cellule HEK293: Informazioni generali e origine

Cosa sono le cellule HEK293?

Le cellule HEK293 sono una linea cellulare di rene embrionale umano derivata dal tessuto renale di un embrione umano elettivamente terminato di paternità sconosciuta. Le cellule sono state create da un biologo olandese di nome Alex Van der Eb nei primi anni Settanta. In seguito sono state immortalizzate attraverso una trasformazione con un adenovirus 5 troncato dal ricercatore Frank Graham.

Inizialmente, le cellule sembravano difficili da trasformare. Tuttavia, dopo molti sforzi continui, la crescita cellulare è avvenuta da un singolo clone trasformato isolato [1]. La trasfezione della cellula con l'adenovirus 5 ha portato all'inclusione dei geni E1A ed E1B nel genoma della cellula, che impedisce la morte cellulare e consente un'abbondante produzione di proteine. Prima dell'immortalizzazione, le cellule renali fetali non erano state adeguatamente caratterizzate, per cui non si conosce il loro esatto tipo di cellula.

I reni embrionali sono composti da cellule endoteliali, epiteliali e fibroblasti, quindi le cellule HEK 293 appartengono probabilmente a queste cellule. Tuttavia, l'mRNA e i prodotti genici suggeriscono che si tratta di cellule neuronali. È possibile che l'aggiunta di Ad5 abbia alterato il fenotipo cellulare e l'espressione genica. Curiosità: il termine "293" in HEK293 si riferisce al 293° esperimento condotto da Graham.

Curiosità: il termine "293" in HEK293 si riferisce al 293° esperimento eseguito da Graham.

Caratteristiche delle cellule HEK293

• Morfologia
• Dimensione delle cellule
• Genoma e ploidia (numero di cromosomi)

Le cellule HEK293 hanno una forma che ricorda le cellule epiteliali. I reni embrionali sono composti principalmente da fibroblasti, cellule endoteliali ed epiteliali. Pertanto, le cellule 293 assomigliano nella forma a uno di questi tipi di cellule.

Le dimensioni delle cellule HEK 293 sono comprese tra 11 e 15 µm e possono essere influenzate dalle condizioni di coltura. In coltura, le cellule possono apparire appiattite se coltivate su una superficie o arrotondate in sospensione. Le cellule HEK293 sono ipotriploidi e circa il 30% delle cellule HEK293 ha una ploidia modale di 64 cromosomi, ma alcune cellule hanno anche più cromosomi. Le cellule presentano anche tre copie del cromosoma X e un frammento di 4 coppie di chilobasi di adenovirus 5 integrato nel cromosoma 19.

Confronto tra la linea cellulare HEK293 e la HEK293T

Dalle cellule parentali HEK 293 sono stati derivati molti derivati, come le comuni cellule 293 HEK293T e HEK293F. Le cellule HEK293T sono uno dei derivati più utilizzati e sono state create incorporando nel genoma originale delle cellule HEK 293 un mutante dell'antigene T di SV40 sensibile alla temperatura. L'espressione dell'antigene T consente la replicazione di plasmidi con origine di replicazione SV40 quando vengono trasfettati nelle cellule 293-T, con conseguente aumento della produzione di proteine ricombinanti [2]. Per ulteriori informazioni sui derivati delle linee cellulari HEK, incluso il loro sviluppo e le loro caratteristiche, consultare questo articolo di revisione.

Nozioni di base sulla coltura delle cellule HEK293: Una guida passo-passo

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La linea cellulare HEK293 nella ricerca e nell'industria

Le applicazioni delle cellule HEK293 sono diverse e significative. Sono spesso utilizzate come sistema per l'espressione e la produzione di proteine ricombinanti. Grazie alla loro origine umana, le proteine prodotte in queste cellule hanno maggiori probabilità di essere simili alle loro controparti umane naturali in termini di struttura e funzione, il che è fondamentale per le applicazioni terapeutiche.

Inoltre, le cellule HEK293 sono spesso impiegate nello studio della funzione e della regolazione genica, in quanto accettano prontamente il DNA estraneo, rendendole un modello eccellente per la manipolazione genetica. Queste cellule svolgono anche un ruolo fondamentale nella produzione di vettori adenovirali, utilizzati per la terapia genica e lo sviluppo di vaccini, compresa la rapida generazione di vaccini per la COVID-19.

Produzione di vaccini e proteine: Le cellule HEK 293 sono adatte alla produzione su larga scala di proteine e vaccini terapeutici. La linea cellulare viene inoltre utilizzata per generare vettori virali come i vettori adeno-associati e adenovirali. Recentemente, le cellule HEK293 sono state utilizzate per la produzione di una proteina ricombinante fondamentale, l'eritropoietina (EPO).

Test antidroga: Le cellule HEK293 sono spesso utilizzate per testare la tossicità di farmaci e prodotti naturali.

Ricerca sul cancro: le cellule 293 sono tumorigeniche e i cambiamenti cruciali dell'espressione genica possono aggravare la tumorigenesi in questa linea cellulare. Pertanto, la linea cellulare 293 è spesso utilizzata negli studi sul cancro per comprendere i meccanismi molecolari sottostanti e lo sviluppo di farmaci.

Studi di trasfezione: La trasfezione è il processo di introduzione di acidi nucleici nelle cellule e le cellule HEK293 sono particolarmente adatte a questo processo. Per saperne di più su questo argomento, si veda il paragrafo seguente.

Il ruolo delle HEK293 nella produzione di vaccini e proteine

Nella produzione di vaccini, le cellule HEK293 sono state fondamentali per lo sviluppo di vaccini a base di adenovirus. La loro capacità di crescere in colture in sospensione consente processi scalabili, fondamentali per soddisfare la domanda globale di vaccini. Inoltre, la loro origine umana offre un vantaggio rispetto ad altre linee cellulari, in quanto possono eseguire modifiche post-traduzionali simili a quelle umane, garantendo l'efficacia biologica dei vaccini prodotti.

La versatilità delle cellule HEK293 si estende alla produzione di proteine complesse, compresi gli anticorpi monoclonali e i biosimilari, utilizzati nel trattamento del cancro, delle malattie autoimmuni e di altre patologie. La loro capacità di ripiegare e modificare accuratamente le proteine le rende una scelta privilegiata nel settore della produzione di proteine ricombinanti.

Perché si usano le cellule HEK293 per la trasfezione?

La trasfezione è il processo di introduzione di acidi nucleici nelle cellule e le cellule HEK293 sono particolarmente adatte a questo processo. Ci sono diversi motivi per cui le cellule HEK293 sono favorite per la trasfezione:

1. Alta efficienza di trasfezione: Le cellule HEK293 hanno un elevato tasso di assorbimento del DNA estraneo, attribuibile alla loro capacità di esprimere alcuni geni virali che facilitano l'ingresso del DNA nella cellula.
2. Crescita robusta: Queste cellule crescono rapidamente e sono relativamente facili da mantenere, il che è vantaggioso per gli esperimenti che richiedono risultati rapidi e affidabili.
3. Adattabilità: le cellule HEK293 possono essere coltivate in diverse condizioni, tra cui colture aderenti o in sospensione, il che le rende adatte alla produzione di proteine su larga scala.
4. Linea cellulare umana: Essendo una linea cellulare umana, forniscono un contesto biologico più rilevante per la biologia umana, particolarmente importante nella ricerca terapeutica, dove la risposta nelle cellule umane è predittiva dei risultati in vivo.
5. Versatilità: Sono in grado di produrre proteine con complesse modifiche post-traslazionali, una caratteristica essenziale per la funzionalità di molte proteine, in particolare degli anticorpi terapeutici.

Protocollo di subcoltura HEK293

Reagenti richiesti

1. 1X soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS)
2. 10% Tripsina-PBS
3. Terreno Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)

Procedura

Preparazione delle cellule

1. Controllare le cellule HEK al microscopio per verificare che siano confluenti al 90% circa.
2. Pulire la postazione di lavoro utilizzando tecniche asettiche e sterilizzare la cappa con luce UV.
3. Pulire l'area di lavoro con etanolo al 70%.
4. Preriscaldare tutti i reagenti in un bagnomaria a 37°C.

Calcolo della frazione split e della quantità di seme

1. Determinare la frazione di divisione, in genere compresa tra 1:5 e 1:20.
2. Calcolare il volume per il pipettaggio utilizzando la formula: Vp = (S)(Vd).

Volumi di terreno e protocolli di divisione

Per la coltura cellulare, recipienti diversi richiedono volumi di terreno specifici e hanno aree di crescita uniche. Ad esempio, una piastra a 6 pozzetti ha un'area di crescita di 4,67 cm^2 per pozzetto e necessita di circa 2,5 mL di terreno, mentre una piastra da 100 mm ha un'area di crescita di 55 cm^2 e richiede 10 mL di terreno. Il processo di divisione delle cellule prevede la rimozione del vecchio terreno di coltura, il lavaggio con PBS, l'incubazione con Accutase, la neutralizzazione con DMEM, la centrifugazione, la risospensione in un nuovo terreno di coltura e quindi la semina su una nuova piastra. Per i passaggi dettagliati e i rapporti per altri recipienti come le fiasche da 100 cm^2 e le piastre da 150 mm, consultare la fonte originale.

Domande frequenti sulle cellule HEK293

Le cellule HEK293 sono molto utilizzate nella ricerca scientifica, il che fa sorgere numerose domande sulla loro natura, origine e caratteristiche. Di seguito, esploriamo alcune di queste domande comuni.