Pubblicato: 2023 | Ultimo aggiornamento: maggio 2026

Cellule HEK293: una pietra miliare nella moderna ricerca cellulare e nella biotecnologia

Le cellule renali embrionali umane 293 (HEK293) sono una linea cellulare renale embrionale umana che ha guadagnato ampia popolarità nella comunità scientifica grazie alla loro versatilità e utilità in una vasta gamma di applicazioni di ricerca. La linea cellulare è stata creata nei primi anni '70 e da allora è stata utilizzata per lo sviluppo di vaccini, la ricerca sul cancro, i test sui farmaci e la trasduzione del segnale. Questo post del blog esplorerà tutti gli aspetti della linea cellulare HEK293, tra cui la sua origine, le informazioni sulla coltura, i vantaggi e gli svantaggi, le applicazioni e le risorse.

Cellule HEK293: informazioni generali e origine

Cosa sono le cellule HEK293?

Le cellule HEK293 sono una linea cellulare renale embrionale umana derivata dal tessuto renale di un embrione umano sottoposto a interruzione volontaria di gravidanza di cui non si conosce la genesi. Le cellule sono state isolate dal biologo olandese Alex Van der Eb nei primi anni '70. Successivamente sono state immortalate tramite trasformazione con un adenovirus 5 troncato dal ricercatore Frank Graham.

Inizialmente, la trasformazione delle cellule sembrava difficile. Tuttavia, dopo molti sforzi continui, si è verificata la crescita cellulare a partire da un singolo clone trasformato isolato [1]. La trasfezione delle cellule con l'adenovirus 5 ha portato all'inclusione dei geni E1A ed E1B nel genoma cellulare, il che impedisce la morte cellulare e consente un'abbondante produzione di proteine. Prima dell'immortalizzazione, le cellule renali fetali non erano state adeguatamente caratterizzate, pertanto il loro esatto tipo cellulare è sconosciuto.

I reni embrionali sono composti da cellule endoteliali, epiteliali e fibroblastiche, quindi le cellule HEK 293 appartengono probabilmente a queste categorie. Tuttavia, l'mRNA e i prodotti genici suggeriscono che si tratti di cellule neuronali. È possibile che l'aggiunta dell'Ad5 abbia alterato il fenotipo cellulare e l'espressione genica. Curiosità: il "293" in HEK293 si riferisce al 293° esperimento condotto da Graham.

Curiosità: il "293" in HEK293 si riferisce al 293° esperimento condotto da Graham.

Caratteristiche delle cellule HEK293

• Morfologia
• Dimensione cellulare
• Genoma e ploidia (numero di cromosomi)

Le cellule HEK293 hanno una forma che ricorda quella delle cellule epiteliali. I reni embrionali sono composti principalmente da cellule fibroblastiche, endoteliali ed epiteliali. Pertanto, le cellule 293 assomigliano a uno di questi tipi di cellule nella forma.

La dimensione delle cellule HEK 293 varia tra gli 11 e i 15 µm, ma può essere influenzata dalle condizioni di coltura. In coltura, le cellule possono apparire appiattite quando crescono su una superficie o arrotondate in sospensione. Le cellule HEK293 sono ipotriploidi e circa il 30% di esse presenta una ploidia modale di 64 cromosomi, ma alcune cellule ne possiedono anche di più. Le cellule presentano inoltre tre copie del cromosoma X e un frammento di 4 kilobasi dell'adenovirus 5 integrato nel cromosoma 19.

Confronto tra la linea cellulare HEK293 e la linea cellulare HEK293T

Molti derivati sono stati ricavati dalle cellule HEK 293 parentali, come i comuni derivati delle cellule 293 HEK293T e HEK293F. Le cellule HEK293T sono uno dei derivati più utilizzati e sono state create incorporando un mutante dell'antigene T SV40 sensibile alla temperatura nel genoma originale delle cellule HEK 293. L'espressione dell'antigene T consente la replicazione dei plasmidi con un'origine di replicazione SV40 quando vengono trasfettati nelle cellule 293-T, portando ad un aumento della produzione di proteine ricombinanti [2]. Per ulteriori informazioni sui derivati della linea cellulare HEK, compreso il loro sviluppo e le loro caratteristiche, consultare questo articolo di revisione.

Nozioni di base sulla coltura cellulare HEK293: una guida passo dopo passo

Condizioni

Informazioni

Tempo di raddoppio della popolazione

Il tempo di raddoppio della linea cellulare HEK293 varia da 24 a 45 ore, con una media di 30 ore.

Colture aderenti o in sospensione

Le cellule HEK293 possono essere coltivate sia in forma aderente che in sospensione. Le cellule aderenti crescono come monostrati, mentre le colture in sospensione crescono come sferoidi.

Densità di semina

Dividere le cellule all'80-90% di confluenza durante la fase di crescita. Staccare le cellule utilizzando Accutase e seminare a una densità compresa tra 1 e 4 x 104 cellule/cm2. Si formerà uno strato confluente in 4 giorni a una densità di semina di 1 x 104 cellule/cm2.

Terreno di coltura

Coltivare in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) con 2 mM di L-glutammina e 10% di siero fetale bovino (FBS). Cambiare il terreno due volte a settimana.

Condizioni di crescita (temperatura, CO2)

Per una crescita ottimale, conservare in un incubatore umidificato a 37 °C con un apporto di CO2 al 5%.

Conservazione

Conservare in fase vapore o liquida in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Evitare la conservazione in congelatore a -80 °C poiché potrebbe compromettere la vitalità cellulare.

Processo di congelamento e terreno

Utilizzare un metodo di congelamento lento per una conservazione ottimale. Congelare in terreno di congelamento CM-1 o CM-ACF disponibile presso CLS.

Processo di scongelamento

Scongelare le cellule congelate in un bagno d'acqua a 37 °C per 1-2 minuti fino a quando rimane un piccolo grumo di ghiaccio. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e aggiungere il mezzo di crescita preriscaldato, quindi centrifugare per eliminare i componenti del mezzo di congelamento. Risospendere il pellet cellulare in mezzo fresco e coltivare in condizioni ottimali.

Livello di biosicurezza

Le cellule HEK293 richiedono una manipolazione di livello di biosicurezza 1.

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La linea cellulare HEK293 nella ricerca e nell'industria

Le applicazioni delle cellule HEK293 sono diverse e significative. Sono spesso utilizzate come sistema per l'espressione e la produzione di proteine ricombinanti. Data la loro origine umana, le proteine prodotte in queste cellule sono più simili alle loro controparti umane naturali in termini di struttura e funzione, il che è fondamentale per le applicazioni terapeutiche.

Inoltre, le cellule HEK293 sono spesso impiegate nello studio della funzione e della regolazione genica, poiché assorbono facilmente il DNA estraneo, rendendole un modello eccellente per la manipolazione genetica. Queste cellule svolgono anche un ruolo fondamentale nella produzione di vettori adenovirali, utilizzati nella terapia genica e nello sviluppo di vaccini, compresa la rapida generazione di vaccini per il COVID-19.

Produzione di vaccini e proteine: le cellule HEK 293 sono adatte alla produzione su larga scala di proteine e vaccini terapeutici. La linea cellulare viene inoltre utilizzata per generare vettori virali come i vettori adeno-associati e adenovirali. Recentemente, le cellule HEK293 sono state utilizzate per la produzione di una proteina ricombinante fondamentale, l'eritropoietina (EPO).

Test sui farmaci: le cellule HEK293 sono spesso utilizzate per testare la tossicità di farmaci e prodotti naturali.

Ricerca sul cancro: le cellule 293 sono tumorigeniche e cambiamenti cruciali nell'espressione genica possono aggravare la tumorigenesi in questa linea cellulare. Pertanto, la linea cellulare 293 è spesso utilizzata negli studi sul cancro per comprendere i meccanismi molecolari sottostanti e lo sviluppo di farmaci.

Studi di trasfezione: la trasfezione è il processo di introduzione di acidi nucleici nelle cellule e le cellule HEK293 sono particolarmente adatte a questo processo. Maggiori informazioni su questo argomento sono fornite di seguito.

Il ruolo delle cellule HEK293 nella produzione di vaccini e proteine

Nella produzione di vaccini, le cellule HEK293 sono state fondamentali per lo sviluppo di vaccini a base di adenovirus. La loro capacità di crescere in colture in sospensione consente processi scalabili, fondamentali per soddisfare la domanda globale di vaccini. Inoltre, la loro origine umana offre un vantaggio rispetto ad altre linee cellulari, poiché sono in grado di eseguire modificazioni post-traduzionali simili a quelle umane, garantendo l'efficacia biologica dei vaccini prodotti.

La versatilità delle cellule HEK293 si estende alla produzione di proteine complesse, tra cui anticorpi monoclonali e biosimilari, utilizzati nel trattamento del cancro, delle malattie autoimmuni e di altre patologie. La loro capacità di ripiegare e modificare accuratamente le proteine le rende la scelta preferita nell'industria della produzione di proteine ricombinanti.

Perché le cellule HEK293 vengono utilizzate per la trasfezione?

La trasfezione è il processo di introduzione di acidi nucleici nelle cellule, e le cellule HEK293 sono particolarmente adatte a questo processo. Ci sono diverse ragioni per cui le cellule HEK293 sono preferite per la trasfezione:

1. Elevata efficienza di trasfezione: le cellule HEK293 hanno un alto tasso di assorbimento del DNA estraneo, attribuibile alla loro capacità di esprimere determinati geni virali che facilitano l'ingresso del DNA nella cellula.
2. Crescita robusta: queste cellule crescono rapidamente e sono relativamente facili da mantenere, il che è vantaggioso per gli esperimenti che richiedono risultati rapidi e affidabili.
3. Adattabilità: le cellule HEK293 possono essere coltivate in una varietà di condizioni, comprese le colture aderenti o in sospensione, il che le rende adatte alla produzione di proteine su larga scala.
4. Linea cellulare umana: in quanto linea cellulare umana, forniscono un contesto biologico più rilevante per la biologia umana, il che è particolarmente importante nella ricerca terapeutica in cui la risposta nelle cellule umane è predittiva dei risultati in vivo.
5. Versatilità: sono in grado di produrre proteine con complesse modificazioni post-traduzionali, una caratteristica essenziale per la funzionalità di molte proteine, in particolare degli anticorpi terapeutici. 

Protocollo di subcoltura HEK293

Reagenti necessari

1. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X
2. PBS con tripsina al 10%
3. Terreno di coltura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)

Procedura

Preparazione delle cellule

1. Controllare le cellule HEK al microscopio per assicurarsi che siano confluenti al 90% circa.
2. Pulire la postazione di lavoro utilizzando tecniche asettiche e sterilizzare la cappa chimica con luce UV.
3. Pulire l'area di lavoro con etanolo al 70%.
4. Preriscaldare tutti i reagenti in un bagno d'acqua a 37 °C.

Calcolo della frazione di divisione e della quantità di seme

1. Determinare la frazione di divisione, tipicamente compresa tra 1:5 e 1:20.
2. Calcolare il volume per il pipettaggio utilizzando la formula: Vp = (S)(Vd).

Volumi dei terreni di coltura e protocolli di divisione

Per la coltura cellulare, recipienti diversi richiedono volumi di terreno specifici e presentano aree di crescita uniche. Ad esempio, una piastra a 6 pozzetti ha un'area di crescita di 4,67 cm^2 per pozzetto e necessita di circa 2,5 mL di terreno, mentre una piastra da 100 mm ha un'area di crescita di 55 cm^2, che richiede 10 mL di terreno. Il processo di divisione delle cellule prevede la rimozione del terreno di coltura vecchio, il lavaggio con PBS, l'incubazione con Accutase, la neutralizzazione con DMEM, la centrifugazione, la risospensione in nuovo terreno di coltura e infine la semina su una nuova piastra. Per i passaggi dettagliati e i rapporti relativi ad altri recipienti, come fiasche da 100 cm² e piastre da 150 mm, si prega di fare riferimento alla fonte originale.

Domande frequenti sulle cellule HEK293

Le cellule HEK293 sono molto utilizzate nella ricerca scientifica, il che fa sorgere numerose domande sulla loro natura, origine e caratteristiche. Di seguito, esploriamo alcune di queste domande comuni.