Tovább a honlapra
Bevásárlókosár 0,00 EUR*
Minden kategória megjelenítése HEK sejtekre alapuló nagy áteresztőképességű GPCR szűrőplatformok Vissza

HEK sejt alapú nagy áteresztőképességű GPCR szűrőplatformok

A G-proteinhez kapcsolt receptorok (GPCR-ek) a humán genomban található membránfehérjék legnagyobb családját képviselik, és a gyógyszercélpontok mintegy 34%-át teszik ki. A Cytionnál felismertük, hogy a hatékony GPCR célzott terápiák kifejlesztéséhez olyan robusztus sejtalapú szűrési platformokra van szükség, amelyek képesek a receptorok aktiválódásának pontos mérésére több ezer vagy millió vegyület esetében. A HEK293 sejtek váltak a GPCR-expresszió és a funkcionális szűrés preferált gazdaszervezetévé, mivel a hatékony receptor-expresszió, az alacsony endogén receptor-háttér és a különböző vizsgálati formátumok kompatibilitásának egyedülálló kombinációját kínálják.

A legfontosabb tudnivalók

  • A HEK293 sejtek ideális hátteret biztosítanak heterológ GPCR-expresszióhoz, minimális endogén receptorok általi interferencia mellett
  • Többféle vizsgálati formátum - kalcium fluxus, cAMP, β-arrestin rekrutáció - lehetővé teszi az útvonalak átfogó vizsgálatát
  • Az automatizált folyadékkezelés és a lemezolvasók lehetővé teszik a napi 100 000 vegyületet meghaladó szűrési teljesítményt
  • A stabil sejtvonal-fejlesztési stratégiák egyensúlyt teremtenek az átviteli követelmények és a vizsgálat konzisztenciája között
  • A torzított agonizmus kimutatása multiplex leolvasást igényel a különböző jelátviteli kaszkádokon keresztül
HEK293-alapú GPCR nagy áteresztőképességű szűrési platform GPCR jelátviteli útvonalak GPCR Gαs ↑cAMP Gαq ↑Ca²⁺ β-arr Toborzás Assay Technologies Kalcium-áramlás Fluo-4/Fura-2 FLIPR/Plate Reader cAMP-mérések HTRF/AlphaScreen GloSensor β-Arrestin PathHunter BRET/NanoBiT Riporter gén CRE-Luc NFAT-Luc HTS munkafolyamat Sejtek beültetése 384/1536 üreg Hatóanyag Adalékolás Detektálás Leolvasás Elemzés Találat kiválasztása HEK293 előnyei GPCR szűréshez Alacsony háttér Minimális endogén GPCR expresszió Tiszta jel/zaj Magas expresszió Hatékony transzfekció Erős CMV promóterek 10⁵-10⁶ receptor/sejt Teljes szignalizáció Minden G fehérje altípus Adaptor fehérjék jelenléte Natív útvonal-kapcsolás Assay kompatibilis Robusztus mikrolemezekben Szuszpenziós adaptáció Automatizált feldolgozás Szűrési átviteli mérőszámok Formátum Üregek/lemez Vegyületek/nap 96 üregű 96 5,000-10,000 384-es üreg 384 20,000-50,000 1536 kút 1536 100,000-500,000 3456-kút 3456 500,000-1,000,000+ Stabil sejtvonalak fejlesztése 1. Vektortervezés szelekciós markerrel 2. HEK293 szülői sejtek transzfekciója 3. Antibiotikum-szelekció (2-4 hét) 4. Egysejtes klónozás (FACS/határhígítás) 5. Klónszűrés az expresszió/funkció szempontjából 6. Sejtbankolás és stabilitásvizsgálat Időzítés: 3-6 hónap © Cytion - A GPCR hatóanyag-kutatás lehetővé tétele

Miért a HEK293 sejtek a GPCR-szűrésben a legjobbak

A HEK293 sejtek számos belső előnyük miatt a GPCR funkcionális vizsgálatok de facto szabványává váltak. Először is, viszonylag alacsony endogén GPCR-expressziójuk minimalizálja a háttérjelzést, amely megzavarhatja a heterológ receptor-vizsgálatokat. Ellentétben bizonyos rákos sejtvonalakkal, amelyek számos GPCR-t expresszálnak funkcionálisan releváns szinten, a HEK293 sejtek tiszta vásznat biztosítanak a receptorok expressziójához.

Másodszor, a HEK293 sejtek az összes fő G-fehérje alosztály (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) expresszálódnak olyan szinten, amely elegendő a különböző receptorok összekapcsolódásának támogatásához. Ez a teljes jelátviteli repertoár lehetővé teszi a natív receptor-G-fehérje kölcsönhatások vizsgálatát anélkül, hogy specifikus G-fehérje alegységek együttes expressziójára lenne szükség.

Harmadszor, a HEK293 sejtek hatékonyan transzfektálódnak több reagensosztály használatával, 90%-ot meghaladó transzfekciós arányt elérve. Ez a hatékonyság magas receptor-expressziós szinteket eredményez - jellemzően 10⁵-10⁶ receptort sejtenként -, ami még a szerény kapcsolási hatékonyságú receptorok esetében is robusztus jelablakokat biztosít.

HEK293T sejtjeink (300189 ) különösen magas transzfekciós hatékonyságot kínálnak az átmeneti GPCR-expresszióhoz, így ideálisak a receptorok kezdeti jellemzésére és a tesztek fejlesztésére, mielőtt elköteleznénk magunkat a stabil sejtvonalak létrehozására.

Assay formátum kiválasztása GPCR-szűréshez

Kalciumfluxus-tesztek: A Gαq-kapcsolt receptorok aktiválják a foszfolipáz C-t, ami kalcium felszabadulását váltja ki az intracelluláris raktárakból. A kalciumérzékeny fluoreszcens festékek, mint például a Fluo-4, Fura-2 vagy a genetikailag kódolt kalciumindikátorok lehetővé teszik e válasz valós idejű mérését. A FLIPR-hez hasonló lemez-alapú fluoreszcencia-leolvasók egyidejűleg képesek mérni a kalcium-tranzienseket egész 384 vagy 1536 lyukú lemezeken, és napi 100 000 adatpontot meghaladó teljesítményt érnek el.

cAMP-mérések: A Gαs-csatolt receptorok stimulálják az adenil-ciklázt, növelve az intracelluláris cAMP-ot, míg a Gαi-csatolt receptorok gátolják a cAMP-termelést. A cAMP-változásokat többféle vizsgálati technológiával lehet kimutatni, beleértve a kompetitív immunpróbákat (HTRF, AlphaScreen), a bioszenzor-alapú megközelítéseket (GloSensor) és a riporter génpróbákat (CRE-luciferáz). Mindegyik különböző előnyöket kínál az érzékenység, a kinetika és az áteresztőképesség terén.

β-aresztin toborzás: A GPCR aktiválása β-arrestin rekrutációt indít el a receptorhoz, amely folyamat fehérjekomplementációs vizsgálatokkal mérhető. Az olyan technológiák, mint a PathHunter (enzimfragment-komplementáció) és a NanoBiT (osztott luciferáz) érzékeny, útvonaltól független méréseket biztosítanak, amelyek a G-fehérje-kapcsolási preferenciától függetlenül a receptorok minden osztályában alkalmazhatók.

Riportergén-mérések: A transzkripciós riporterrendszerek a downstream jelátviteli eseményeket mérik, és az érzékenységet fokozó erősítést kínálnak. A CRE-luciferáz riporterek a cAMP útvonal aktiválódását detektálják, az NFAT-luciferáz a kalcium jelátvitelre reagál, a SRE-luciferáz pedig több útvonalat is nyomon követ. Bár lassabbak, mint a közvetlen másodlagos hírvivő mérések, a riporterpróbák kiváló jel-háttér arányt biztosítanak.

Stabil sejtvonal fejlesztési stratégiák

A nagy áteresztőképességű szűrési kampányokhoz általában stabil sejtvonalakra van szükség, amelyek a cél GPCR-t konzisztens szinten expresszálják több milliárd tesztkútban. A stabil sejtvonalak fejlesztése a receptort és egy szelektálható markert is tartalmazó vektorok tervezésével kezdődik, ami lehetővé teszi a stabilan transzfektált sejtek dúsítását.

A HEK293 sejtjeink (300192 ) a stabil sejtvonalak létrehozásának standard szülői vonalaként szolgálnak. A transzfekciót és az antibiotikum-szelekciót (jellemzően 2-4 hét) követően a túlélő sejteket limitáló hígítással vagy fluoreszcencia-aktivált sejtválogatással (FACS) egysejtes klónozásnak vetjük alá. Az egyes klónokat ezután kiterjesztik és jellemzik a receptor expressziós szintje, a funkcionális válasz nagysága és a vizsgálat robusztussága szempontjából.

A sejtvonalak szűrésének kritikus minőségi jellemzői közé tartozik az expresszió stabilitása hosszabb passzázsok során, a referencia standardokhoz viszonyított konzisztens farmakológia és a miniatürizált lemezformátumokban nyújtott robusztus teljesítmény. A minősített sejtek bankjait a szűrési kampány korai szakaszában kell létrehozni a teljes konzisztens teljesítmény biztosítása érdekében.

A gyorsabb ütemezés érdekében a HEK293 EBNA sejtjeink (300264 ) lehetővé teszik a stabil expressziót epizomális vektorokból, ami potenciálisan csökkenti a fejlesztési időt, miközben fenntartja az expresszió konzisztenciáját.

Miniatürizálási és automatizálási megfontolások

A szűrési áteresztőképesség maximalizálása megköveteli a miniatürizálást 384-lyukú, 1536-lyukú vagy akár 3456-lyukú formátumokra. A HEK293 sejtek jól alkalmazkodnak a csökkentett térfogatú, nagy sűrűségű tenyésztéshez, bár a sejtsűrűség, a tenyésztési feltételek és az inkubációs idők optimalizálása szükséges lehet minden egyes formátumváltásnál.

A szuszpenzióval adaptált HEK293 sejtek előnyöket kínálnak az automatizált szűrési munkafolyamatok számára. A HEK293 szuszpenzió-adaptált (300686 ) sejtjeinket közvetlenül a tenyésztőedényekből lehet adagolni a vizsgálati lemezekbe tripszinizálás nélkül, csökkentve a kezelési lépéseket és javítva a konzisztenciát. Az automatizált folyadékkezelőkkel való kompatibilitás lehetővé teszi a valódi sétáló szűrési kampányokat.

A tesztlemezek stabilitási követelményei formátumonként eltérőek. A kalciumfluxus-tesztek jellemzően a festék betöltését követő órákon belüli mérést igényelnek, míg a cAMP- és β-aresztin-tesztek egy éjszakán át tartó inkubációt tesznek lehetővé a leolvasás előtt. E korlátozások megértése segíti a szűrési logisztikát és a berendezések ütemezését.

Adatelemzés és találatazonosítás

A GPCR-szűrési kampányok hatalmas adathalmazokat generálnak, amelyek robusztus elemzési pipeline-okat igényelnek. A statisztikai paraméterek, beleértve a Z'-tényezőt, a jel-háttér arányt és a variációs együtthatót, lemezenként értékelik a vizsgálat minőségét. A minőségi küszöbértékeket nem teljesítő lemezeket inkább meg kell ismételni, mint elemezni.

A találatazonosítási kritériumok egyensúlyt teremtenek az érzékenység és a hamis pozitív arány között. A referenciavegyületekhez viszonyított 50%-os aktiválási vagy gátlási aktivitási küszöbértékek ésszerű kiindulópontot jelentenek, bár az optimális határértékek a könyvtár összetételétől és a program céljaitól függnek. Az elsődleges találatok koncentráció-válasz megerősítése kiküszöböli a műtermékeket, és rangsorolja a vegyületeket a nyomon követéshez.

A modern GPCR hatóanyag-kutatás egyre nagyobb hangsúlyt fektet az elfogult agonizmusra - olyan vegyületekre, amelyek bizonyos jelátviteli utakat előnyben részesítik másokkal szemben. Az elfogult vegyületek kimutatásához párhuzamos vizsgálatokra van szükség, amelyek több útvonalat mérnek (pl. G-protein aktiváció versus β-arrestin rekrutáció), és a technikai torzítások elkerülése érdekében gondosan ügyelni kell a vizsgálatok érzékenységére és kinetikájára.

Ajánlott termékek GPCR-szűréshez:

Ez a weboldal cookie-kat használ, hogy a legjobb élményt nyújtsa a weboldalon... További információ.
- Imprint

Azt észleltük, hogy Ön egy másik országban él, vagy a jelenleg kiválasztottól eltérő böngészőnyelvet használ. Szeretné elfogadni a javasolt beállításokat?

Zárja be a