Emberi primer sejtek

Mik azok az emberi primer sejtek?

Az elsődleges sejtek a megfelelő szövetek legtisztább reprezentációi. A szövetből izolálják és úgy dolgozzák fel őket, hogy ideális körülmények között tenyészetben megtelepedhessenek. Mivel szövetből származnak, és nem módosították őket, jobban utánozzák az in vivo állapotot, és normális fiziológiai viselkedést mutatnak. Emiatt hasznos modellek lehetnek a sejtfarmakológia, a toxikológia és a fiziológia kutatásában (beleértve az anyagcsere, az öregedés és a jelátvitel vizsgálatát is). Fontos szem előtt tartani, hogy az elsődleges sejtek tenyésztése és fenntartása nagyobb kihívást jelent, mint a folyamatos sejtvonalaké, mivel élettartamuk rövidebb, és egy bizonyos számú sejtosztódás után leállnak az osztódással (vagyis öregednek). A sejtjelátviteli útvonalak vizsgálatát bonyolítja a donoroktól származó primer sejtek természetes variabilitása, valamint az áttenyésztési gyakorlatok. A jelátviteli vizsgálatok megkezdése előtt a kutatók gyakran szűrést végeznek annak megállapítására, hogy a sejtek reagálnak-e a általánosan használt ingerekre. Az idő- és pénzpazarlás elkerülése érdekében a primer sejteket a szűrés előtt stimulálhatják a főbb jelátviteli útvonalak aktiválása érdekében.

Miért érdemes emberi primer sejteket használni?

Az immortalizált sejtvonalakat általában sejtvizsgálatokhoz használják. Bár a tudósok elismerték, hogy a sejtvonalakból eredő biológiai változások káros hatással lehetnek azok fiziológiai jelentőségének tanulmányozására. Az emberi primer sejtek használata javítja a sejtkultúrákból nyert adatok fiziológiai értékét, és ezeket egyre inkább fontosnak tartják a biológiai folyamatok, a betegségek lefolyásának és a gyógyszerfejlesztés tanulmányozásában.

Az emberi primer sejteket széles körben használják az intercelluláris és intracelluláris kommunikáció, a fejlődésbiológia, valamint a rák, a Parkinson-kór és a cukorbetegség hátterében álló mechanizmusok in vitro vizsgálataiban, továbbá számos más preklinikai és kutatói biológiai területen. A kutatók régóta használnak halhatatlanná tett sejtvonalakat a szövetek működésének vizsgálatához; azonban a nyilvánvaló mutációkkal és kromoszómális rendellenességekkel rendelkező sejtvonalak nem feltétlenül alkalmasak a normál sejtek és a betegség korai stádiumainak helyettesítésére. Egy adott szöveti sejttípus pontosabb modellje ma már elérhető az adott szövetből izolált, elsődleges sejtkultúra-táptalajon és kiegészítőkkel fenntartott emberi elsődleges sejtek felhasználásával.

Mi az elsődleges sejtkultúra?

Az immortalizált sejtvonalak használata helyett az elsődleges sejtkultúra során a sejteket közvetlenül egy többsejtű szervezetből, a testön kívül tenyésztik. Egyes országokban, például az Egyesült Királyságban, jogilag is elismert tény, hogy az elsődleges sejtkultúrák jobban reprezentálják az in vivo szöveteket, mint a sejtvonalak. Mindazonáltal az elsődleges sejteknek megfelelő szubsztrátumra és tápanyagokra van szükségük a növekedéshez, és egy bizonyos számú osztódás után szeneszkens fenotípust fejlesztenek ki, ami miatt véglegesen leáll az osztódásuk. Ez a két tényező ösztönzi a sejtvonalak létrehozását. Mind a természetesen halhatatlanná vált primer sejtek (pl. a HeLa-sejtek), mind a mesterségesen halhatatlanná vált primer sejtek (pl. a HEK-sejtek) korlátlan ideig tenyészthetők sejtkultúrában.

Emberi primer sejtek szövet típusok szerint

A tudományos kutatásokban a leggyakrabban használt emberi primer sejtek közé tartoznak a hámsejtek, a fibroblasztok, a keratinociták, a melanociták, az endoteliális sejtek, az izomsejtek, az immunsejtek, valamint a mesenchimális őssejtekhez hasonló őssejtek. Kezdetben a tenyészetek heterogének (a szövetben jelen lévő sejttípusok keverékét képviselik), és in vitro körülmények között csak egy meghatározott ideig tarthatók életben. A transzformáció egy olyan in vitro folyamat, amely lehetővé teszi az emberi primer sejtek manipulálását korlátlan szubkultúrák létrehozása céljából. A transzformáció természetes úton is bekövetkezhet, vagy kémiai anyagokkal, illetve vírusokkal is kiváltható. A genetikai transzformációt követően az elsődleges tenyészet – elegendő tápanyag és hely biztosítása esetén – korlátlanul osztódhat, és halhatatlanná vált másodlagos sejtvonalat hozhat létre.

Endoteliális sejtek

A rákkezelés, a sebgyógyulás, a sejtjelátvitel kutatása, a nagy áteresztőképességű és nagy tartalmú szűrés, valamint a toxikológiai szűrés csak néhány azok közül a területek közül, amelyek profitálhatnak az elsődleges endoteliális sejtek kutatási eszközként való felhasználásából.

Keratinociták

A felnőtt emberi bőr felhámjából vagy újszülött előbőréből nyert keratinociták döntő szerepet játszanak olyan bőrbetegségek kutatásában, mint a pikkelysömör és a rák.

Hámsejtek

A rákkutatásoktól a toxikológiai vizsgálatokig az elsődleges epiteliális sejtek felbecsülhetetlen értékű forrásnak bizonyultak a szervezet természetes védekező mechanizmusainak modellezésében.

Fibroblasztok

Az indukált pluripotens őssejtek (iPS-sejtek) előállítása és a sebgyógyulás vizsgálata csak néhány példa az elsődleges fibroblasztok számos felhasználási területéből.

Immunsejtek

A perifériás vér mononukleáris sejtjei, röviden PBMC-k, a vérben található, kerek sejtmaggal rendelkező mononukleáris sejtek. Főként limfocitákból és monocitákból állnak, amelyek fontos szerepet töltenek be az immunválasz során. A perifériás vér mononukleáris sejtjeit gyakran használják fertőzések diagnosztizálására vagy az esetleges vakcinavédelem kimutatására. A T-sejtek által közvetített celluláris immunválasz megértése gyakran döntő fontosságú.

Melanociták

A melanociták, azaz a melanin pigmentet termelő specializált bőrsejtek, hasznos modellek olyan kutatási témákhoz, mint a sebgyógyulás, a toxicitás, a melanoma, a bőr ultraibolya (UV) sugárzásra adott reakciója, a bőrbetegségek és a kozmetikumok.

Őssejtek

Az őssejtek képesek a legkülönbözőbb sejttípusokká differenciálódni. Differenciálódási képességüknek köszönhetően új lehetőségeket nyújtanak az emberi szövetek és egészségügyi állapotok modellezéséhez.

Mesenchimális őssejtek

A mezenchimális őssejtek, más néven MSC-k, különböző emberi forrásokból nyerhetők, például csontvelőből, zsírszövetből, köldökzsinór-szövetből (Wharton-zseléből) és magzatvízből (a magzatot körülvevő folyadékból), és in vitro tenyészthetők. Ezek a felnőtt stromális őssejtek képesek a legkülönbözőbb sejttípusokká fejlődni. E sejttípusok közé tartoznak többek között a csontsejtek, a porcsejtek, az izomsejtek, az idegsejtek, a bőrsejtek és a szaruhártyasejtek.

Simaizomsejtek

Az üreges szervekben az elsődleges simaizomsejtek (SMC-k) bélelik ki a belső felületet, és közvetítik a kontraktilitást. A rák és más betegségek mellett az SMC-k felhasználhatók a magas vérnyomásos fibrózis modellezésére is.

Elsődleges sejtek és sejtvonalak

Akár spontán mutáció révén – mint a transzformált rákos sejtvonalak esetében –, akár szándékos módosítás útján – mint a rákgének mesterséges előállításánál –, a folyamatos sejtvonalak végtelenül szaporodásra képesek lettek (halhatatlanná váltak). Általános szabály, hogy a folyamatos sejtvonalak megbízhatóbbak és kezelésük kényelmesebb, mint az elsődleges sejteké. Végtelenül szaporodhatnak, és gyors hozzáférést biztosítanak a lényeges adatokhoz. A folyamatos sejtvonalak használatának vannak bizonyos korlátai, többek között az a tény, hogy genetikailag módosítottak/transzformáltak, ami megváltoztathatja a fiziológiai jellemzőket, és nem felel meg az in vivo állapotnak, valamint hogy ez az idő múlásával és a jelentős passzálások során tovább változhat.

Fejlemények az elsődleges sejtkultúra területén

Az elsődleges sejtek arról híresek, hogy nehéz velük dolgozni. A folyamat azonban egyre könnyebbé válik, köszönhetően az elsődleges sejtkultúra terén elért fejlődésnek, a teljesen optimalizált protokollokkal rendelkező, kereskedelmi forgalomban kapható elsődleges sejtek elérhetőségének, valamint az alacsonyabb erőfeszítést igénylő új elemzési technikáknak.

A kétdimenziós sejtkultúrából a háromdimenziós sejtkultúrába való átállás a terület egyik legfontosabb mérföldkövének számít. A szövet-specifikus szerkezet, a sejt-sejt kölcsönhatások, valamint a mechanikai és biokémiai jelátvitel a 2D-kultúrában gyengülhet. Így ezeknek a kultúráknak a biológiai értéke korlátozott.

Másrészt a háromdimenziós sejtkultúra lehetővé teszi a sejtek szaporodását és a háromdimenziós extracelluláris vázszerkezettel való kölcsönhatást. Ezáltal a sejtek egymással és az extracelluláris mátrixszal is kölcsönhatásba léphetnek, ami a háromdimenziós kultúrákat fiziológiailag relevánsabbá teszi. Ez a módszer az in vivo reakciók előrejelzésében elért pontosságának köszönhetően forradalmi jelentőségűvé vált olyan területeken, mint a gyógyszerkutatás és -fejlesztés. Ennek köszönhetően a legkorszerűbb technológiák, mint például a betegektől származó organoidok és az „orgánum-a-chipen” (organs-on-a-chip) modellek, rendkívül kontextusfüggő modelleket nyújtanak a gyógyszervizsgálathoz és -fejlesztéshez.

Az elsődleges sejtek előállítása az elsődleges tenyésztés egyik szűk keresztmetszete. Ennek leküzdéséhez általában nagyobb mennyiségű szövetre van szükség, ami nehézséget jelenthet. Azonban a javuló analitikai érzékenység új utakat nyit. Például az egysejt-technológia – amely magában foglalja a szekvenálást, a Western blotot és a tömegcitometriát – alkalmazásával csökken az igény a nagy mennyiségű elsődleges sejt tenyésztésére.

Az elsődleges sejtkultúra ígéretes kilátásai

Az elsődleges sejtkultúra általános nehézségeit a technológiai fejlődés enyhíti. Ez a módszer pedig gyorsan felváltja a többit, mint a sejt- és molekuláris biológiai kutatások és gyakorlat aranystandardját. A vakcina-gyártás, a szervpótlás, az őssejtterápiák, a rákkutatás és még sok más terület jelentősen profitálhat az elsődleges sejtkultúra folyamatos fejlődéséből.

Tippek és trükkök az elsődleges sejtkultúrához

A sejtek szaporításának igényei

Az elsődleges sejtek tenyésztésének két leggyakoribb módszere a szuszpenziós tenyésztés és a felületen történő tenyésztés (2D). Egyes sejtek képesek szabadon lebegni a véráramban anélkül, hogy valaha is tapadnának egy felülethez (például a perifériás vérből származó sejtek). Különböző sejtvonalakat hoztak létre úgy, hogy szuszpenziós tenyészetekben szaporodjanak, ahol olyan sűrűséget érhetnek el, amely 2D-s tenyésztési körülmények között elérhetetlen. Azokat az elsődleges sejteket, amelyeknek in vitro szaporodáshoz rögzülésre van szükségük, adhezív sejteknek nevezik, és ide tartoznak a szilárd szövetekben található sejtek is. Az adhéziós tulajdonságok javítása, valamint a növekedéshez és a differenciálódáshoz szükséges egyéb jelek biztosítása érdekében ezeket a sejteket általában lapos, bevonat nélküli műanyag edényben tenyésztik, de esetenként mikrohordozón is. Ez utóbbi bevonható extracelluláris mátrix fehérjékkel (például kollagénnel és lamininnal). A sejtkultúrában használt táptalaj egy alapközegből áll, amelyet a megfelelő növekedési faktorokkal és citokinekkel egészítettek ki. A sejtinkubátor egy speciális típusú laboratóriumi inkubátor, amelyet a sejtek tenyésztésére és fenntartására használnak egy meghatározott hőmérsékleten és gázkeverékben (emlős sejtek esetében jellemzően 37 °C, 5% CO₂). A tenyésztett sejt típusától függően az optimális feltételek jelentősen eltérhetnek egymástól. A tenyésztett sejtek típusától függően az optimális tenyészközeg egyedi tényezők kombinációját tartalmazza, ideértve többek között a pH-értéket, a glükózkoncentrációt, a növekedési faktorokat és egyéb tápanyagok jelenlétét.

A tenyészközegben lévő antibiotikumok elengedhetetlenek az elsődleges tenyészet létrehozása során, hogy megakadályozzák a gazdaszövetből származó szennyeződést. Egyes antibiotikum-kezelések a gentamicin, a penicillin, a sztreptomicin és az amfotericin B kombinációját tartalmazzák. Az antibiotikumok hosszabb ideig történő alkalmazása azonban nem ajánlott, mivel egyes hatóanyagok (például az amfotericin B) hosszú távon toxikus hatást gyakorolhatnak a sejtekre.

A legtöbb primer sejt öregedési folyamaton megy keresztül, és egy bizonyos számú populációdublálódás után leáll az osztódásuk, ezért elengedhetetlen, hogy az izolálás után életben tartsuk őket. A sejtek hosszú távú életképessége szakértői sejtkultivációs technikákat és ideális tenyésztési feltételeket igényel (ideértve a megfelelő táptalajt, hőmérsékletet, gázkeveréket, pH-értéket, növekedési faktorok koncentrációját, tápanyagok jelenlétét és a glükóz jelenlétét). Mivel a táptalaj kiegészítésére használt növekedési faktorok közül sokat állati vérből nyernek (a vérből származó összetevők szennyeződésveszélyt hordoznak), ajánlott azok használatát minimálisra csökkenteni vagy teljesen elkerülni. Fontos továbbá az aszeptikus technika alkalmazása is.

Átültetés és fenntartás

Amikor az izolált sejtek tapadnak a tenyésztőedény felületéhez, ez jelzi a fenntartási fázis kezdetét. A tapadás általában a tenyésztés megkezdésétől számított 24 órával következik be. A sejteket akkor kell átültetni, amikor elértek egy bizonyos konfluencia-százalékot, és aktívan szaporodnak. Mivel a konfluenciát elérő sejtek differenciálódhatnak, és az átültetés után lassabb szaporodást mutathatnak, a legjobb, ha az elsődleges sejtkultúrákat átültetjük, mielőtt elérnék a 100%-os konfluenciát.

Az új tápközegben történő átültetés fenntartja a rögzítésfüggő sejtek exponenciális növekedését. Az egyrétegű sejtkultúrák átültetése megszakítja a sejtek közötti és a sejten belüli kölcsönhatásokat. Alacsony koncentrációjú proteolitikus enzimeket, például tripszint/EDTA-t alkalmaznak az adhezív primer sejtek kivonására a monorétegekből vagy szövetekből. A sejtek disszociálása és egysejtű oldatba hígítása után megszámolják őket, majd friss tenyésztőedényekbe helyezik át, hogy újra tapadjanak és szaporodjanak.

Krioprezerváció és visszanyerés

A krioprezerváció az élő sejteket alacsony hőmérsékleten történő fagyasztással tartja fenn. Az emberi primer sejtek krioprezerválása és felolvasztása megakadályozza a sejtek elhalását és károsodását a tárolás és a felhasználás során. Az emberi primer sejteket DMSO-val vagy glicerinnel védik a fagyás ellen (a megfelelő hőmérsékleten és szabályozott fagyási sebességgel). A fagyasztási folyamatnak fokozatosnak kell lennie, percenként -1 °C-os hőmérsékletcsökkenéssel, a jégkristályok kialakulásának megakadályozása érdekében. A hosszú távú tároláshoz folyékony nitrogén (-196 °C) vagy -130 °C alatti hőmérséklet szükséges.

A krioprezervált sejtek felolvasztásához elegendő a fagyasztott sejteket körülbelül 1–2 percig 37 °C-os vízfürdőbe meríteni. Az emberi primer sejteket a fagyasztóból való kiolvasztás után nem szabad centrifugálni (mivel rendkívül érzékenyek a krioprezerválásból való helyreállítás során bekövetkező károsodásra). A sejtek felolvasztás után azonnal lemezre ültethetők, és ez elősegíti a tapadást a tenyészetekben az ültetés utáni első 24 órában. 1 Miután a krioprezervált primer sejtek megtapadtak, a használt táptalajt el kell távolítani (mivel a DMSO káros a primer sejtekre, és csökkentheti a felolvasztás utáni életképességet).