Emlős sejtkultúra: Alapjai és technikái
Az emlőssejtkultúra a biológiai kutatások egyik alaptechnikája, amely lehetővé teszi a tudósok számára, hogy élő szervezeteken kívüli, ellenőrzött környezetben tanulmányozzák a sejteket. Ez a folyamat magában foglalja a sejtek izolálását a szövetekből, gondosan ellenőrzött körülmények között történő fenntartásukat és szaporításukat különböző kísérleti célokra. Az emlőssejtkultúra alapvető fontosságú a sejtfolyamatok és a betegségmechanizmusok megértéséhez, valamint új terápiák kifejlesztéséhez, beleértve az immortális sejtvonalakat használókat is
A legfontosabb tudnivalók:
- A sejtek izolálhatók szövetekből enzimatikus feltárással vagy ültetvénykultúrás módszerekkel
- Az elsődleges sejtek élettartama korlátozott, míg az immortalizált sejtvonalak korlátlanul szaporodhatnak
- A tenyésztési körülmények, beleértve a táptalaj összetételét, kritikusak a sejtek túlélése és szaporodása szempontjából
- A sejteket szuszpenzióban vagy adherens kultúrákban lehet tenyészteni, típusuktól és a kutatási igényektől függően
- Az általános tenyésztőközegek közé tartozik a MEM, DMEM és RPMI 1640, amelyek mindegyike a specifikus sejttípusokhoz igazodik
- A tipikus tenyésztési körülmények közé tartozik a 37°C hőmérséklet, 5% CO2 és 95% relatív páratartalom
- A lehetséges szennyeződések elkerülése érdekében egyre gyakrabban használnak szérum alternatívákat, mint például a humán trombocita lizátum (hPL)
Sejtizolációs technikák
A sejtkultúra létrehozásának folyamata a sejtek izolálásával kezdődik a szövetekből. Ennek elvégzésére többféle módszer létezik, amelyek mindegyike különböző szövettípusokhoz és kutatási célokhoz alkalmas. Vérminták esetében a sejtek izolálása viszonylag egyszerű, a fehérvérsejtek a tenyésztés elsődleges célpontjai, növekedési képességeik miatt. A szilárd szövetek összetettebb izolációs technikákat igényelnek. Az egyik gyakori módszer az enzimatikus emésztés, ahol olyan enzimeket, mint a kollagenáz, tripszin vagy pronáz használnak az extracelluláris mátrix lebontására, és az egyes sejteket szuszpenzióba helyezik. Alternatív megoldásként a kutatók alkalmazhatják az explantátumtenyésztési módszert, ahol kis szövetdarabokat helyeznek közvetlenül a növekedési közegbe, lehetővé téve a sejtek kivándorlását és szaporodását. Az e módszerek közötti választás gyakran az adott szövettípustól, a kívánt sejtpopulációtól és a tervezett kísérleti felhasználástól függ. Fontos megjegyezni, hogy a közvetlenül egy szervezetből izolált sejteket elsődleges sejteknek nevezzük, és néhány kivételtől eltekintve, mint például a tumorból származó sejtek, általában korlátozott élettartamúak a kultúrában, mielőtt elöregednek
Alapvető termékek emlőssejtkultúrához
| Termék neve | Termékszám | Kategória | Alkalmazás |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/L glükóz, w: 4 mM L-glutamin, w: 1,5 g/L NaHCO3, w: 1,0 mM nátrium-piruvát | 820300a | Kultúrmédiumok | Általános célú táptalaj különböző emlőssejttípusokhoz |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L glükóz, w: 1,6 mM L-Glutamin, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM nátrium-piruvát, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Kultúrmédiumok | Emlőssejtek, különösen hámsejtek széles köréhez alkalmas |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabil glutamin, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kultúrmédiumok | Általában limfoid sejtekhez és hibrid sejtvonalakhoz használják |
| Accutase | 830100 | Sejtek szétválasztása | Kíméletes sejtleválasztó oldat tapadó sejtekhez |
| CM-1 fagyasztási közeg | 800150 | Kriokonzerválás | Emlős sejtek fagyasztásához és hosszú távú tárolásához |
| CM-ACF fagyasztóközeg, szérummentes | 800650 | Kriokonzerválás | Állati komponensektől mentes táptalaj sejtek fagyasztásához |
| PBS | 860015 | Pufferoldat | A sejtek mosásához és a pH-egyensúly fenntartásához |
| Endotélsejt-növesztőközeg | 820731 | Speciális médiumok | Endotélsejtek tenyésztéséhez optimalizált |
| Mykoplazma-vizsgálat | 900159 | Minőségellenőrzés | Elengedhetetlen a tenyészetekben a mikoplazma-szennyeződés kimutatásához |
| Sejtvonal-hitelesítés - humán | 900154 | Minőségellenőrzés | Humán sejtvonalak azonosságának ellenőrzése |
Ez a táblázat az emlős sejttenyésztéshez szükséges termékekből mutat be egy válogatást. A sejttenyésztési termékek teljes választékát, beleértve a speciális médiumokat és reagenseket is, megtalálja a Médiumok és reagensek kategóriaoldalon.
- A Trypsin kíméletes alternatívája
Az Accutase egy sejtleválasztó megoldás, amely forradalmasítja a sejtkultúra-ipart. Proteolitikus és kollagenolitikus enzimek keveréke, amely a tripszin és a kollagenáz hatását utánozza. A tripszinnel ellentétben az Accutase nem tartalmaz emlős vagy bakteriális összetevőket, és sokkal kíméletesebb a sejtekhez, így ideális megoldás a sejtek rutinszerű leválasztására a standard szövettenyésztő műanyag edényekről és az adhéziós bevonatú műanyag edényekről. Ebben a blogbejegyzésben az Accutase előnyeit és felhasználási lehetőségeit vizsgáljuk meg, valamint azt, hogy hogyan változtatja meg a sejtkultúra játékát.
Az Accutase előnyei
Az Accutase számos előnnyel rendelkezik a hagyományos tripszinoldatokkal szemben. Először is, minden olyan esetben használható, amikor bármilyen tapadó sejtvonal kíméletes és hatékony leválasztására van szükség, így a tripszin közvetlen helyettesítője. Másodszor, az Accutase rendkívül jól működik embrionális és neuronális őssejteken, és bizonyítottan megőrzi e sejtek életképességét a passzázs után. Harmadszor, az Accutase megőrzi a legtöbb epitópot a későbbi áramlási citometriás elemzéshez, így ideális a sejtfelszíni markerek elemzéséhez.
Ezenkívül az Accutase-t nem kell semlegesíteni, amikor a tapadó sejteket passziválják. A sejtek szétválasztása után további médium hozzáadása felhígítja az Accutázt, így az már nem képes a sejtek leválasztására. Ez kiküszöböli az inaktiválási lépés szükségességét, és időt takarít meg a sejtkultúra-technikusok számára. Végül, az Accutase-t nem kell aliquotálni, és egy palack 2 hónapig stabil a hűtőszekrényben.
Az Accutase alkalmazásai
Az Accutase a tripszinoldat közvetlen helyettesítője, és használható a sejtvonalak passziválására. Ezenkívül az Accutase jól teljesít a sejtek leválasztásakor számos sejtfelszíni marker áramlási citometriás elemzéséhez és sejtválogatáshoz. Az Accutase kezelés további downstream alkalmazásai közé tartozik a sejtfelszíni markerek elemzése, vírusnövekedési vizsgálat, sejtproliferáció, tumorsejt-migrációs vizsgálatok, rutin sejtpassázs, termelés skálázása (bioreaktor) és áramlási citometria.
Az Accutase összetétele
Az Accutase nem tartalmaz emlős vagy bakteriális összetevőket, és egy természetes enzimkeverék proteolitikus és kollagénbontó enzimaktivitással. Sokkal alacsonyabb koncentrációban van megfogalmazva, mint a tripszin és a kollagenáz, így kevésbé mérgező és kíméletesebb, de ugyanolyan hatékony.
Az Accutase hatékonysága
Az Accutase bizonyítottan hatékony az elsődleges és őssejtek leválasztásában és a sejtek magas életképességének fenntartásában az állati eredetű enzimekkel, például a tripszinnel összehasonlítva. a sejtek 100%-a 10 perc után visszanyerhető, és az Accutase automatikus emésztésének köszönhetően a sejteket akár 45 percig is az Accutase-ban hagyhatjuk.
Összefoglalva
Összefoglalva, az Accutase egy hatékony megoldás, amely megváltoztatja a sejtkultúra játékát. Kíméletes természetével, hatékonyságával és sokoldalúságával az Accutase a tripszin ideális alternatívája. Ha megbízható és hatékony megoldást keres a sejtleválasztáshoz, az Accutase az Ön számára a megfelelő megoldás.
A foszfátpufferelt sóoldat (PBS) a biológiai és kémiai kutatásokban széles körben használt pufferoldat. Fontos szerepet játszik a pH-egyensúly és az ozmolaritás fenntartásában a különböző kísérleti eljárások során, beleértve a szövetfeldolgozást és a sejttenyésztést. PBS-oldatunkat nagy gondossággal, nagy tisztaságú összetevőkkel állítjuk össze, hogy minden kísérletben biztosítsuk a stabilitást és a megbízhatóságot. PBS-ünk ozmolaritása és ionkoncentrációja szorosan utánozza az emberi szervezetben uralkodó értékeket, így izotóniás és a legtöbb sejtre nem mérgező.
PBS-oldatunk összetétele
A PBS oldatunk ultratisztaságú foszfátpufferek és sóoldatok pH-értékre beállított keveréke. Az 1X munkakoncentrációban a következőket tartalmazza:
8000 mg/l nátrium-klorid (NaCl)
200 mg/l kálium-klorid (KCl)
1150 mg/L nátrium-foszfát kétbázisú vízmentes (Na2HPO4)
200 mg/L Kálium-foszfát monobázikus vízmentes (KH2PO4)
Ez az összetétel optimális pH
- és ionegyensúlyt biztosít, amely a biológiai alkalmazások széles köréhez alkalmas.
A PBS-oldatunk alkalmazásai
PBS-oldatunk ideális a biológiai kutatások különböző alkalmazásaihoz. Izotóniás és nem toxikus tulajdonságai alkalmassá teszik az anyagok hígítására és a sejttartályok öblítésére. Az EDTA-t tartalmazó PBS-oldatok hatékonyan oldják a megtapadt és csomósodott sejteket. Kétértékű fémeket, például cinket azonban nem szabad a PBS-hez adni, mivel ez csapadékképződést okozhat. Ilyen esetekben a Good pufferek használata ajánlott. Ezenkívül a PBS-oldatunk elfogadható alternatívája a vírusszállító közegnek az RNS-vírusok, köztük a SARS-CoV-2 szállítására és tárolására.
Minőségellenőrzés
Steril szűrt
Tárolás és eltarthatósági idő
Tárolja +2°C és +25°C között, fénytől védve.
Felbontás után 2°C és 25°C között tárolja, és 24 hónapon belül használja fel.
Szállítási feltételek
Környezeti hőmérséklet
Karbantartás
Hűtve, +2°C és +8°C között, sötétben tárolja. Kerülje a fagyasztást és a gyakori melegítést +37°C-ra, mivel ez csökkenti a termék minőségét.
Ne melegítse a közeget 37°C fölé, és ne használjon ellenőrizetlen hőforrásokat, például mikrohullámú készülékeket.
Ha a táptalajnak csak egy részét kívánja felhasználni, vegye ki a szükséges mennyiséget, és felhasználás előtt melegítse fel szobahőmérsékletűre.
Összetétel
Kategória
Összetevők
Koncentráció (mg/l)
Sók
Kálium-klorid
200
Kálium-foszfát monobázikus vízmentes
200
Nátrium-klorid
8000
Nátrium-foszfát kétbázisú, vízmentes
1150
Elemzési módszer
A CLS rövid és hosszú távú vizsgálatokat is kínál a mikoplazma kimutatására. Az előbbi esetben a mintákat közvetlenül a beérkezés után vizsgálják, míg az utóbbi esetben a sejttenyésztést indítják el, és a sejteket 14 napos antibiotikummentes tenyésztés után vizsgálják. A mikoplazma-vizsgálat kétpontos kimutatási rendszerrel történik, mind a PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen), mind a Certus QC
- mycoADVANCED detektáló kit (Certus) segítségével.
Minták
A gyorsteszthez legalább 50 µl, 50 000 sejtet tartalmazó sejtszuszpenziót kell biztosítani. A sejtszuszpenzió szobahőmérsékleten szállítható.
A prémium teszthez legalább 1 millió sejtet kell biztosítani megfelelő fagyasztási táptalajban, hogy a sejtek tenyésztéséhez és az azt követő vizsgálathoz robusztus és egészséges tenyészetet biztosítson. Kérjük, a mintákat szárazjégen szállítsa.
Kérjük, töltse ki a mikoplazma-vizsgálati mintaformanyomtatványt, és csatolja a mintaszállítmányhoz.
Kolorimetrikus riportervizsgálat
Ez a teszt egy sejtalapú kolorimetriás vizsgálat. Mikoplazma jelenlétében egy riporter sejtvonal egy jelátviteli kaszkádot indukál, amely a közeg színének vörösről kékre történő változását váltja ki. A vizsgálatot 96 lyukú multiwell lemezekben végzik. A jeleket 620-655 nm-en mikrolemez spektrofotométerrel detektáljuk. Az összes mikoplazma
- és akoleplazma-faj, de a sejtkultúrában lévő egyéb szennyeződések, például baktériumok is kimutathatók.
Izotermikus amplifikáció
Az izotermikus amplifikáció egy gyors és megbízható teszt, amely a mikoplazma-specifikus DNS izotermikus amplifikációján és egy DNS-interkaláló festékkel történő valós idejű kimutatáson alapul. A vizsgálat hat leggyakoribb fajt képes kimutatni, amelyek a fertőzések >95%-át teszik ki: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis és A.laidlawii. A szekvencia-homológia miatt más mycoplasma fajok is kimutathatók (M.pneumoniae, M.gallisepticum és M.synoviae). Annak megállapítására, hogy a minta mikoplazma pozitív vagy negatív, az olvadási hőmérsékletet (Tm) vizsgálják.
Következtetés: Az emlőssejtkultúra kulcsfontosságú szerepe a modern kutatásban
Az emlőssejtkultúra forradalmasította a biológiai és orvosi kutatást, mivel hatékony eszközöket biztosít a tudósok számára az összetett sejtfolyamatok, a betegségmechanizmusok és a lehetséges terápiás beavatkozások tanulmányozásához. A primer sejtek izolálásától az immortalizált sejtvonalak kifejlesztéséig ez a technika a modern tudományos eszköztár nélkülözhetetlen részévé vált
Az emlőssejtkultúra útja a gondos izolálási technikákkal kezdődik, a sejtek speciális közegben történő aprólékos fenntartásán keresztül halad, és a különböző tudományterületeken történő alkalmazások széles skálájával ér véget. Legyen szó rákkutatásról, gyógyszerkutatásról vagy alapvető sejtbiológiáról, az emlőssejtek in vitro tenyésztésének és manipulálásának képessége soha nem látott utakat nyitott meg a tudományos felfedezések előtt
Az emlőssejtkultúra sikerének kulcsa a gondosan ellenőrzött körülmények, amelyek között a sejteket fenntartják. A tenyésztőközeg összetételétől az inkubátorok pontos környezeti paramétereiig minden szempontot úgy optimalizálnak, hogy a lehető legjobban utánozzák a sejtek természetes körülményeit. Ez a részletekre fordított figyelem biztosítja a kísérletek megbízhatóságát és reprodukálhatóságát, ami a jó tudományos gyakorlat egyik sarokköve
Az immortalizált sejtvonalak, például a széles körben használt HeLa sejtek kifejlesztése tovább bővítette a sejttenyésztés lehetőségeit. Ezek a sejtvonalak következetes, könnyen hozzáférhető sejtmodelleket biztosítanak, amelyek számos tudományágban felgyorsították a kutatást
A jövőbe tekintve az emlős sejtkultúra tovább fejlődik. A 3D tenyésztési technikák, az organoidok fejlesztése és a kémiailag meghatározott közegek használata a sejtkultúrában lehetséges határokat feszegetik. Ezek a fejlesztések azt ígérik, hogy az in vitro modellek még közelebb kerülnek az in vivo rendszerek komplexitásához, ami forradalmasíthatja a gyógyszerkutatást, a személyre szabott orvoslást és az emberi biológia megértését
Összefoglalva, az emlőssejtkultúra továbbra is dinamikus és alapvető fontosságú technika az élettudományi kutatásban. További tökéletesítése és alkalmazása kétségtelenül döntő szerepet fog játszani a biológia és az orvostudomány legégetőbb kérdéseinek megoldásában, és még évekig a tudományos fejlődés motorja lesz