Guía completa para la congelación de células: Garantizar la viabilidad y la esterilidad
La congelación de células es un proceso crítico en la gestión de cultivos celulares, que garantiza el almacenamiento a largo plazo y la conservación de líneas celulares valiosas. Tanto si se trabaja con células humanas como animales, es fundamental seguir protocolos precisos y mantener técnicas asépticas estrictas para lograr una crioconservación satisfactoria.
Esta guía proporciona instrucciones detalladas sobre los materiales, reactivos y procedimientos paso a paso necesarios para congelar eficazmente las células preservando su viabilidad y esterilidad. Siguiendo estas directrices, los investigadores pueden almacenar con confianza y revivir posteriormente cultivos celulares con una pérdida mínima de viabilidad celular, manteniendo la integridad y fiabilidad de sus resultados experimentales.
Para empezar, es esencial establecer un entorno de trabajo estéril. Las técnicas asépticas adecuadas desempeñan un papel crucial a la hora de prevenir la contaminación y garantizar la esterilidad de los cultivos.
Técnica aséptica
Siga técnicas asépticas durante todo el proceso para garantizar la esterilidad de los cultivos.
Proceso completo de congelación de células
Este diagrama de flujo proporciona una guía visual detallada de los pasos esenciales para la correcta congelación de células. Siga estos procedimientos para asegurar una alta viabilidad e integridad celular durante el proceso de criopreservación.
Preparación del medio de congelación
Prepare el medio de congelación crioprotector según el tipo de célula:
- Cultivos en medio que contenga FBS: 90% FBS + 10% DMSO o 70% medio de crecimiento, 20% FBS y 10% DMSO
- Células que requieren glicerol: 90% FBS + 10% glicerol
Considere la posibilidad de adquirir nuestro medio de congelación preformulado:
- Medio decongelación CM-1: Para protocolos que requieran un medio que contenga Suero Fetal Bovino (FBS)
- Medio de congelación CM-ACF - sin suero: Para una alternativa sin FBS
Etiquetado y documentación
Etiquete los crioviales con los siguientes datos:
- Fecha
- Nombre del investigador
- Número de célula
- Número de paso
- Tipo de célula
- Cualquier información adicional (por ejemplo, modificaciones genéticas)
Preparación celular
Para células adherentes:
- Controlar las células hasta que alcancen una confluencia del 85-95%
- Aspirar el medio de cultivo antiguo
- Enjuagar la monocapa celular con PBS libre de calcio y magnesio
- Separar las células con Accutase, tripsina o tripsina-EDTA y neutralizar con medio de cultivo si es necesario
- Transferir la suspensión celular a un tubo Falcon de 50 mL
Para las células en suspensión
- Comprobar la densidad y el estado de las células al microscopio
- Transferir la suspensión celular directamente a un tubo Falcon de 50 mL
Recuento celular y centrifugación
- Contar las células con un hemocitómetro o un contador celular automatizado
- Centrifugar a 300 g durante 3-5 minutos a temperatura ambiente para granular las células
- Aspirar el sobrenadante con cuidado, evitando perturbar el sedimento celular
- Calentar el medio de congelación preparado a 37°C antes de su uso
Criopreservación
- Resuspender el sedimento celular en medio de congelación hasta una densidad de 2,0 millones de células/mL para células adherentes, y 5 millones de células/mL para células en suspensión, o la concentración deseada
- Alícuota de 1,0 ml (o más según sea necesario) de la suspensión celular en crioviales etiquetados
- Utilizar un método de congelación lenta antes de transferir las células al almacenamiento a largo plazo
| ? Método | ? Pasos |
|---|---|
|
❄️ Congelación manual |
1️⃣ Colocar las células en medio de congelación en un congelador a 4°C durante 40 minutos. 2️⃣ Transferir a un congelador a -80°C durante 24 horas. 3️⃣ Almacenar las células en nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo |
|
? Utilización de Mr. Frosty |
1️⃣ Preparar las células en crioviales con medio de congelación. 2️⃣ Colocar los crioviales en el contenedor Mr. Frosty. 3️⃣ Almacenar a -80°C durante 24 horas antes de transferir al nitrógeno líquido |
|
? Congelador de velocidad controlada |
1️⃣ Programar el aparato para que disminuya gradualmente la temperatura. 2️⃣ Colocar las células preparadas en el congelador. 3️⃣ Tras el ciclo de congelación, transfiera las células a nitrógeno líquido |
- Almacenar los crioviales a temperaturas inferiores a -130°C o en nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.
Materiales y reactivos
- crioviales de 1-2 mL
- Unidad de congelación CoolCell® o congelador de velocidad controlada
- Medio de congelación crioprotector (por ejemplo, medio crioprotector DIY, CM-1, CM-ACF o medios especializados)
- Suero fetal bovino (FBS) o medio acondicionado
- DMSO o glicerol
- PBS sin calcio ni magnesio
- Acutasa, tripsina o tripsina-EDTA (para células adherentes)
- tubos Falcon de 15 ml o 50 ml
- Hemocitómetro o contador celular automático
- Centrifugadora