Publicado: 2023 | Última revisión: mayo de 2026
Guía completa para la congelación de células: cómo garantizar la viabilidad y la esterilidad
La congelación de células es un proceso fundamental en la gestión de cultivos celulares, ya que garantiza el almacenamiento y la conservación a largo plazo de valiosas líneas celulares. Tanto si se trabaja con células humanas como animales, seguir protocolos precisos y mantener técnicas asépticas estrictas es fundamental para lograr una crioconservación satisfactoria.
Esta guía ofrece instrucciones detalladas sobre los materiales y reactivos necesarios, así como procedimientos paso a paso para congelar células de forma eficaz, preservando al mismo tiempo su viabilidad y esterilidad. Siguiendo estas directrices, los investigadores pueden almacenar con confianza y reactivar posteriormente los cultivos celulares con una pérdida mínima de viabilidad celular, manteniendo la integridad y la fiabilidad de sus resultados experimentales.
Para empezar, es esencial establecer un entorno de trabajo estéril. Las técnicas asépticas adecuadas desempeñan un papel crucial a la hora de prevenir la contaminación y garantizar la esterilidad de los cultivos.
Técnica aséptica
Siga las técnicas asépticas durante todo el proceso para garantizar la esterilidad de los cultivos.
Proceso completo de congelación celular
Este diagrama de flujo ofrece una guía visual detallada de los pasos esenciales que intervienen en la congelación adecuada de las células. Siga estos procedimientos para garantizar una alta viabilidad e integridad celular durante el proceso de crioconservación.
Preparación del medio de congelación
Prepare el medio de congelación crioprotector según el tipo de célula:
- Cultivos en medios que contienen FBS: 90 % de FBS + 10 % de DMSO o 70 % de medio de crecimiento, 20 % de FBS y 10 % de DMSO
- Células que requieren glicerol: 90 % de FBS + 10 % de glicerol
Considere la posibilidad de adquirir nuestro medio de congelación preformulado:
- Medio de congelación CM-1: para protocolos que requieran un medio que contenga suero fetal bovino (FBS)
- Medio de congelación CM-ACF - sin suero: para una alternativa sin FBS
Etiquetado y documentación
Etiquete los criotubos con los siguientes datos:
- Fecha
- Nombre del investigador
- Número de células
- Número de paso
- Tipo de célula
- Cualquier información adicional (p. ej., modificaciones genéticas)
Preparación de las células
Para células adherentes:
- Supervise las células hasta que alcancen una confluencia del 85-95 %
- Aspirar el medio de cultivo viejo
- Enjuagar la monocapa celular con PBS sin calcio ni magnesio
- Desprenda las células con Accutase, tripsina o tripsina-EDTA y neutralícelas con medio de cultivo si es necesario
- Transfiera la suspensión celular a un tubo Falcon de 50 ml
Para células en suspensión:
- Compruebe la densidad y el estado de las células al microscopio
- Transfiera la suspensión celular directamente a un tubo Falcon de 50 ml
Recuento celular y centrifugación
- Cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automático
- Centrifugue a 300 g durante 3-5 minutos a temperatura ambiente para sedimentar las células
- Aspirar el sobrenadante con cuidado, evitando alterar el sedimento celular
- Calentar el medio de congelación preparado a 37 °C antes de su uso
Criopreservación
- Resuspender el sedimento celular en el medio de congelación hasta una densidad de 2,0 millones de células/ml para células adherentes y de 5 millones de células/ml para células en suspensión, o hasta la concentración deseada
- Repartir en alícuotas de 1,0 ml (o más, según sea necesario) de la suspensión celular en crioviales etiquetados
- Utilice un método de congelación lenta antes de transferir las células al almacenamiento a largo plazo
- ? Método
- ? Pasos
-
❄️
Congelación manual -
1️⃣ Coloque las células en medio de congelación en un congelador a 4 °C durante 40 minutos.
2️⃣ Transfiéralas a un congelador a -80 °C durante 24 horas.
3️⃣ Almacene las células en nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo. -
?
Uso de Mr. Frosty -
1️⃣ Prepare las células en criotubos con medio de congelación.
2️⃣ Coloque los criotubos en el recipiente Mr. Frosty.
3️⃣ Almacene a -80 °C durante 24 horas antes de transferirlas a nitrógeno líquido. -
?
Congelador de velocidad controlada -
1️⃣ Programe el dispositivo para que la temperatura disminuya gradualmente.
2️⃣ Coloque las células preparadas en el congelador.
3️⃣ Tras el ciclo de congelación, transfiera las células a nitrógeno líquido.
- Almacene los crioviales a temperaturas inferiores a -130 °C o en nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.
Materiales y reactivos
- Crioviales de 1–2 ml
- Unidad de congelación CoolCell® o congelador de velocidad controlada
- Medio de congelación crioprotector (p. ej., medios crioprotectores caseros, CM-1, CM-ACF o medios especializados)
- Suero fetal bovino (FBS) o medios acondicionados
- DMSO o glicerol
- PBS sin calcio ni magnesio
- Accutase, tripsina o tripsina-EDTA (para células adherentes)
- Tubos Falcon de 15 ml o 50 ml
- Hemocitómetro o contador celular automático
- Centrífuga