Cultivo de células de mamíferos: Fundamentos y técnicas
El cultivo de células de mamífero es una técnica fundamental en la investigación biológica, que permite a los científicos estudiar células en un entorno controlado fuera de los organismos vivos. Este proceso implica aislar células de tejidos, mantenerlas en condiciones cuidadosamente controladas y propagarlas para diversos fines experimentales. El cultivo de células de mamífero es crucial para comprender los procesos celulares, los mecanismos de las enfermedades y el desarrollo de nuevas terapias, incluidas las que utilizan líneas celulares inmortales
Puntos clave:
- Las células pueden aislarse de los tejidos mediante digestión enzimática o métodos de cultivo de explantes
- Las células primarias tienen una vida útil limitada, mientras que las líneas celulares inmortalizadas pueden proliferar indefinidamente
- Las condiciones de cultivo, incluida la composición de los medios de crecimiento, son fundamentales para la supervivencia y la proliferación celular
- Las células pueden cultivarse en suspensión o como cultivos adherentes, dependiendo de su tipo y de las necesidades de la investigación
- Los medios de cultivo habituales son MEM, DMEM y RPMI 1640, cada uno adaptado a un tipo celular específico
- Las condiciones de crecimiento habituales son 37 °C de temperatura, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa
- Cada vez se utilizan más alternativas al suero, como el lisado de plaquetas humanas (hPL), para evitar posibles problemas de contaminación
Técnicas de aislamiento celular
El proceso de creación de un cultivo celular comienza con el aislamiento de las células de los tejidos. Existen varios métodos para lograrlo, cada uno de ellos adecuado para diferentes tipos de tejidos y objetivos de investigación. En el caso de las muestras de sangre, el aislamiento celular es relativamente sencillo, siendo los glóbulos blancos el principal objetivo del cultivo debido a su capacidad de crecimiento. Los tejidos sólidos requieren técnicas de aislamiento más complejas. Un método habitual es la digestión enzimática, en la que se utilizan enzimas como la colagenasa, la tripsina o la pronasa para romper la matriz extracelular y liberar células individuales en suspensión. Alternativamente, los investigadores pueden emplear el método de cultivo de explantes, en el que pequeños trozos de tejido se colocan directamente en medios de crecimiento, permitiendo que las células migren hacia fuera y proliferen. La elección entre estos métodos depende a menudo del tipo de tejido específico, la población celular deseada y el uso experimental previsto. Es importante señalar que las células aisladas directamente de un organismo se denominan células primarias y, con algunas excepciones como las células derivadas de tumores, suelen tener una vida útil limitada en cultivo antes de sufrir senescencia
Productos esenciales para el cultivo de células de mamífero
| Nombre del producto | Número de producto | Categoría | Aplicación |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/L Glucosa, w: 4 mM L-Glutamina, w: 1,5 g/L NaHCO3, w: 1,0 mM Piruvato sódico | 820300a | Medios de cultivo | Medio de uso general para varios tipos de células de mamíferos |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L Glucosa, w: 1,6 mM L-Glutamina, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM Piruvato sódico, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Medios de cultivo | Adecuado para una amplia gama de células de mamíferos, especialmente células epiteliales |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM Glutamina estable, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Medios de cultivo | Comúnmente utilizado para células linfoides y líneas celulares híbridas |
| Accutase | 830100 | Disociación celular | Solución de disociación celular suave para células adherentes |
| Medio de congelación CM-1 | 800150 | Criopreservación | Para la congelación y el almacenamiento a largo plazo de células de mamíferos |
| Medio de congelación CM-ACF, sin suero | 800650 | Criopreservación | Medio sin componentes animales para la congelación de células |
| PBS | 860015 | Solución tampón | Para lavar las células y mantener el equilibrio del pH |
| Medio de crecimiento de células endoteliales | 820731 | Medio especializado | Optimizado para el cultivo de células endoteliales |
| Prueba de micoplasma | 900159 | Control de calidad | Esencial para detectar la contaminación por micoplasma en los cultivos |
| Autenticación de línea celular - Humana | 900154 | Control de calidad | Verifica la identidad de líneas celulares humanas |
Esta tabla representa una selección de productos esenciales para el cultivo de células de mamíferos. Si desea consultar nuestra gama completa de productos para el cultivo celular, incluidos medios y reactivos especializados, visite nuestra página de la categoría Medios y reactivos.
Accutase es una solución de desprendimiento celular lista para usar y filtrada estérilmente, diseñada como una alternativa suave a la tripsina/EDTA para disociar células mamíferas adherentes de material plástico estándar para cultivo de tejidos y superficies recubiertas para la adhesión. Combina la actividad enzimática proteolítica y colagenolítica en una solución salina equilibrada para proporcionar una disociación eficaz pero controlada, preservando las proteínas de la superficie celular y favoreciendo una alta viabilidad tras el paso y una rápida readhesión.
La formulación de Accutase se basa en la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) con EDTA y rojo de fenol como indicador visual del pH. Las enzimas son de origen no mamífero y no bacteriano, lo que hace que Accutase sea especialmente adecuado para la investigación con células madre, los procesos de desarrollo de vacunas y cualquier aplicación en la que sea necesario minimizar los contaminantes de origen animal o microbiano. La solución se autoinhibe a 37 °C, por lo que no se requiere ningún reactivo neutralizante ni medio que contenga suero tras la desadhesión: las células pueden transferirse directamente a un medio fresco.
Características principales
Líquido 1x filtrado estéril listo para usar: no requiere dilución ni reconstitución
Actividad enzimática combinada proteolítica y colagenolítica para una disociación suave
Cada lote está estandarizado con una actividad de disociación definida para garantizar la consistencia entre lotes
Enzimas de origen no mamífero y no bacteriano
Se autoinhibe a 37 °C: no se necesita solución neutralizante
Formulado en PBS de Dulbecco con EDTA
Incluye rojo de fenol como indicador visual de pH
pH 6,8 – 7,8
Aplicaciones típicas
Accutase disocia suavemente una amplia variedad de tipos de células adherentes y sensibles, incluidas las células madre embrionarias humanas (hESC), las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), las células madre neurales, las neuronas primarias y las líneas adherentes cultivadas habitualmente, como HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 y A549. Entre los casos de uso típicos se incluyen:
Subcultivo y pases rutinarios de células mamíferas adherentes
Disociación suave de células individuales de hESC, iPSC y otras líneas sensibles
Preparación de muestras para citometría de flujo y análisis FACS
Análisis de marcadores de superficie celular en los que la integridad del epítopo es importante
Ensayos de migración, proliferación y apoptosis celular
Ensayos de quiescencia mediante privación de suero y estudios de transfección de oncogenes
Ensayos de migración de células tumorales y de la cresta neural
Ampliación de la producción en flujos de trabajo con biorreactores
Para el trabajo rutinario, aplique aproximadamente 10 ml de Accutase por cada 75 cm² de superficie de cultivo e incube durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. El tiempo de incubación óptimo debe determinarse para cada línea celular y no debe superar una hora. Antes de la adición, enjuague la capa celular con una solución salina libre de Ca²⁺/Mg²⁺, como DPBS sin calcio ni magnesio, para eliminar el suero residual y los cationes divalentes.
Manipulación y almacenamiento
Almacene el frasco sin abrir congelado a -15 °C o menos. Descongele a temperatura ambiente o durante la noche a una temperatura de entre +2 °C y +8 °C. No descongele Accutase en un baño de agua a 37 °C, ya que las temperaturas elevadas reducen la actividad enzimática. Tras la descongelación, la solución puede almacenarse hasta 2 meses a una temperatura de entre +2 °C y +8 °C; no la almacene a temperatura ambiente. No precaliente el reactivo a 37 °C antes de su aplicación; añádalo directamente a las células lavadas a temperatura ambiente. Para una vida útil prolongada, se recomienda el fraccionamiento en alícuotas de un solo uso para evitar ciclos de descongelación repetidos. Trabaje siempre en condiciones asépticas.
Calidad
Fabricado bajo estrictas normas de calidad. Cada lote de Accutase se filtra en condiciones estériles y se somete a pruebas de esterilidad, pH, aspecto y actividad de disociación para garantizar un rendimiento constante y reproducible de un lote a otro.
Especificaciones del producto
Especificaciones
Detalle
Tipo de productoReactivo de desprendimiento/disociación celular
FormatoLíquido filtrado estéril, listo para usar
Volumen100 ml
Concentración de trabajo1x (listo para usar)
Actividad enzimáticaProteolítica y colagenolítica combinadas
Origen de la enzimaNo mamífero y no bacteriano
Sistema tampónPBS de Dulbecco con EDTA
Indicador de pHRojo de fenol
Rango de pH6,8 – 7,8
AspectoSolución transparente, de color rojo pálido a naranja
Temperatura de almacenamiento-15 °C o menos
Estabilidad tras la descongelaciónHasta 2 meses a una temperatura de entre +2 °C y +8 °C
Volumen de uso recomendado~10 ml por cada 75 cm² de superficie de cultivo
Tiempo de incubación habitual5 – 10 minutos a temperatura ambiente
Condiciones de envíoCongelado en hielo seco
Uso previstoSolo para uso en investigación y fabricación posterior
Formulación (composición por litro)
Componente
Concentración (mg/L)
Sales inorgánicas
Cloruro de sodio (NaCl)8000,00
Hidrogenofosfato disódico (Na₂HPO₄)1150,00
Cloruro de potasio (KCl)200,00
Dihidrogenofosfato de potasio (KH₂PO₄)200,00
Otros componentes
EDTA · 4Na (EDTA tetrasódico)220,00
Rojo de fenol3,00
Mezcla enzimática patentada (actividad proteolítica y colagenolítica)1x
Accutase es una marca registrada de Innovative Cell Technologies, Inc.
La solución salina tamponada con fosfato (PBS) es una solución tampón muy utilizada en la investigación biológica y química. Desempeña un papel crucial en el mantenimiento del equilibrio del pH y la osmolaridad durante diversos procedimientos experimentales, como el procesamiento de tejidos y el cultivo celular. Nuestra solución PBS está meticulosamente formulada con ingredientes de gran pureza para garantizar la estabilidad y fiabilidad en cada experimento. La osmolaridad y las concentraciones de iones de nuestra PBS imitan fielmente las del cuerpo humano, por lo que es isotónica y no tóxica para la mayoría de las células.
Composición de nuestra solución PBS
Nuestra solución PBS es una mezcla de soluciones salinas y tampones de fosfato de grado ultrapuro con pH ajustado. A una concentración de trabajo de 1X, contiene:
8000 mg/L de cloruro sódico (NaCl)
200 mg/L Cloruro potásico (KCl)
1150 mg/L Fosfato sódico dibásico anhidro (Na2HPO4)
200 mg/L Fosfato potásico monobásico anhidro (KH2PO4)
Esta composición garantiza un pH y un equilibrio iónico óptimos, adecuados para una amplia gama de aplicaciones biológicas.
Aplicaciones de nuestra solución PBS
Nuestra solución PBS es ideal para diversas aplicaciones en investigación biológica. Sus propiedades isotónicas y no tóxicas la hacen adecuada para la dilución de sustancias y el enjuague de contenedores celulares. Las soluciones de PBS que contienen EDTA son eficaces para desprender células adheridas y aglomeradas. Sin embargo, los metales divalentes como el zinc no deben añadirse al PBS, ya que pueden provocar precipitación. En tales casos, se recomiendan los tampones de Good. Además, nuestra solución de PBS es una alternativa aceptable al medio de transporte viral para el transporte y almacenamiento de virus de ARN, incluido el SARS-CoV-2.
Control de calidad
Filtrado estéril
Almacenamiento y vida útil
Almacenar a +2°C a +25°C, protegido de la luz.
Una vez abierto, conservar entre 2°C y 25°C y utilizar antes de 24 meses.
Condiciones de envío
Temperatura ambiente
Conservación
Conservar refrigerado a +2°C a +8°C en la oscuridad. Evitar la congelación y el calentamiento frecuente a +37°C, ya que reduce la calidad del producto.
No calentar el medio a más de 37°C ni utilizar fuentes de calor no controladas, como aparatos de microondas.
Si sólo se va a utilizar una parte del medio, retirar la cantidad necesaria y calentarla a temperatura ambiente antes de su uso.
Composición
Categoría
Componentes
Concentración (mg/L)
Sales
Cloruro de potasio
200
Fosfato potásico monobásico anhidro
200
Cloruro sódico
8000
Fosfato sódico dibásico anhidro
1150
Método de análisis
CLS ofrece pruebas a corto y largo plazo para la detección de micoplasmas. En el primero, las muestras se analizan inmediatamente después de su llegada, mientras que en el segundo se inicia el cultivo celular y las células se analizan tras 14 días de cultivo sin antibióticos. El análisis de micoplasmas se realiza mediante un sistema de detección de dos puntos con el PlasmoTest™
- Kit de detección de micoplasmas (Invivogen) y el Certus QC
- kit de detección mycoADVANCED (Certus).
Muestras
Para la prueba rápida, proporcione un mínimo de 50 µl de suspensión celular que contenga 50.000 células. La suspensión celular puede enviarse a temperatura ambiente.
Para la prueba premium, por favor proporcione un mínimo de 1 millón de células en un medio de congelación adecuado para asegurar un cultivo robusto y sano para el cultivo y posterior prueba de las células. Envíe las muestras en hielo seco.
Rellene el formulario de muestras para la prueba de micoplasma e inclúyalo con su envío de muestras.
Ensayo reportero colorimétrico
Esta prueba es un ensayo colorimétrico basado en células. En presencia de micoplasma, una línea celular reportera induce una cascada de señalización que desencadena un cambio de color en el medio de rojo a azul. El ensayo se realiza en placas multipocillo de 96 pocillos. Las señales se detectan en un espectrofotómetro de microplacas a 620-655 nm. Se detectan todas las especies de micoplasma y acholeplasma, pero también otros contaminantes del cultivo celular, como las bacterias.
Amplificación isotérmica
La amplificación isotérmica es una prueba rápida y fiable basada en la amplificación isotérmica de ADN específico de micoplasma combinada con la detección en tiempo real mediante un colorante intercalante de ADN. El ensayo es capaz de detectar seis de las especies más comunes que representan >95% de las contaminaciones: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis y A.laidlawii. Debido a la homología de secuencia, también se detectarán otras especies de micoplasma (M.pneumoniae, M.gallisepticum y M.synoviae). Para identificar si la muestra es micoplasma positiva o negativa, se estudia la temperatura de fusión (Tm).
Conclusiones: El papel fundamental del cultivo de células de mamífero en la investigación moderna
El cultivo de células de mamífero ha revolucionado la investigación biológica y médica, proporcionando a los científicos potentes herramientas para estudiar procesos celulares complejos, mecanismos de enfermedades y posibles intervenciones terapéuticas. Desde el aislamiento de células primarias hasta el desarrollo de líneas celulares inmortalizadas, esta técnica se ha convertido en una parte indispensable del instrumental científico moderno
El viaje del cultivo de células de mamífero comienza con unas cuidadosas técnicas de aislamiento, progresa a través del meticuloso mantenimiento de las células en medios especializados y culmina en una amplia gama de aplicaciones en diversos campos de estudio. Ya se trate de la investigación del cáncer, el descubrimiento de fármacos o la biología celular básica, la capacidad de cultivar y manipular células de mamífero in vitro ha abierto vías sin precedentes para la exploración científica
La clave del éxito del cultivo de células de mamífero son las condiciones cuidadosamente controladas en las que se mantienen las células. Desde la composición de los medios de cultivo hasta los parámetros ambientales precisos de las incubadoras, todos los aspectos se optimizan para imitar al máximo las condiciones naturales de las células. Esta atención al detalle garantiza la fiabilidad y reproducibilidad de los experimentos, piedra angular de la buena práctica científica
El desarrollo de líneas celulares inmortalizadas, como las ampliamente utilizadas células HeLa, ha ampliado aún más las posibilidades del cultivo celular. Estas líneas celulares proporcionan modelos celulares consistentes y fácilmente disponibles que han acelerado la investigación en numerosas disciplinas
De cara al futuro, el cultivo de células de mamífero sigue evolucionando. Los avances en las técnicas de cultivo en 3D, el desarrollo de organoides y el uso de medios químicamente definidos están ampliando las posibilidades del cultivo celular. Estos avances prometen acercar aún más los modelos in vitro a la complejidad de los sistemas in vivo, revolucionando potencialmente el descubrimiento de fármacos, la medicina personalizada y nuestra comprensión de la biología humana
En conclusión, el cultivo de células de mamífero sigue siendo una técnica dinámica y esencial en la investigación de las ciencias de la vida. Su perfeccionamiento y aplicación continuados desempeñarán sin duda un papel crucial a la hora de abordar algunas de las cuestiones más acuciantes de la biología y la medicina, impulsando el progreso científico en los años venideros