Komplexní průvodce zmrazováním buněk: Zajištění životaschopnosti a sterility

Zmrazování buněk je kritickým procesem při správě buněčných kultur, který zajišťuje dlouhodobé skladování a uchování cenných buněčných linií. Ať už pracujete s lidskými nebo zvířecími buňkami, je pro úspěšné kryokonzervace nejdůležitější dodržovat přesné protokoly a přísné aseptické techniky.

Tato příručka obsahuje podrobné pokyny k potřebným materiálům, činidlům a postupům krok za krokem, které umožňují efektivní zmrazení buněk při zachování jejich životaschopnosti a sterility. Dodržováním těchto pokynů mohou výzkumní pracovníci s jistotou uchovávat a později oživovat buněčné kultury s minimální ztrátou životaschopnosti buněk a zachovat tak integritu a spolehlivost výsledků svých experimentů.

Na začátku je nezbytné vytvořit sterilní pracovní prostředí. Správné aseptické techniky hrají zásadní roli při prevenci kontaminace a zajištění sterility kultur.

Aseptická technika

V průběhu celého procesu dodržujte aseptické techniky, abyste zajistili sterilitu kultur.

Komplexní proces zmrazení buněk

Tento vývojový diagram poskytuje podrobného vizuálního průvodce základními kroky, které se podílejí na správném zmrazení buněk. Dodržováním těchto postupů zajistíte vysokou životaschopnost a integritu buněk během procesu kryokonzervace.

Příprava mrazicího média

Připravte kryoprotektivní mrazicí médium podle typu buněk:

Kultivační média obsahující FBS: dMSO : 90 % FBS + 10 % DMSO nebo 70 % růstového média, 20 % FBS a 10 % DMSO
Buňky vyžadující glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerolu

Zvažte pořízení našeho předpřipraveného mrazicího média:

Pro protokoly, které vyžadujímédium obsahující fetální hovězí sérum (FBS)
Mrazicí médium CM-ACF - bez séra: Pro alternativu bez FBS

Označování a dokumentace

Kryovialy označte následujícími údaji:

Datum
Jméno výzkumníka
Číslo buňky
Číslo pasáže
Typ buňky
Jakékoli další informace (např. genetické modifikace)

Příprava buněk

Pro adherentní buňky:

Sledovat buňky, dokud nedosáhnou 85-95% konfluence
Aspirujte staré kultivační médium
Opláchněte buněčnou monovrstvu PBS bez vápníku a hořčíku
Oddělte buňky pomocí akutázy, trypsinu nebo trypsinu-EDTA a v případě potřeby je neutralizujte kultivačním médiem
Přeneste buněčnou suspenzi do 50 ml zkumavky Falcon

Pro suspenzní buňky:

Zkontrolujte hustotu a stav buněk pod mikroskopem
Přeneste buněčnou suspenzi přímo do 50 ml zkumavky Falcon

Počítání buněk a centrifugace

Spočítejte buňky pomocí hemocytometru nebo automatického počítadla buněk
Odstřeďujte při 300 g po dobu 3-5 minut při pokojové teplotě, aby se buňky peletovaly
Opatrně odsajte supernatant, aby nedošlo k narušení buněčné pelety
Před použitím zahřejte připravené zmrazovací médium na 37 °C

Kryokonzervace

Resuspendujte buněčné pelety v mrazicím médiu na hustotu 2,0 milionu buněk/ml pro adherentní buňky a 5 milionů buněk/ml pro suspenzní buňky nebo na požadovanou koncentraci
Alikvotujte 1,0 ml (nebo více podle potřeby) buněčné suspenze do označených kryovialek
Před přenesením buněk do dlouhodobého skladu použijte metodu pomalého zmrazování

? Metoda	? Kroky
❄️ Ruční zmrazení	1️⃣ Vložte buňky do mrazicího média do mrazničky o teplotě 4 °C na 40 minut. 2️⃣ Přeneste na 24 hodin do mrazničky o teplotě -80 °C. 3️⃣ Pro dlouhodobé uchování uchovávejte buňky v tekutém dusíku
? Použití přístroje Mr. Frosty	1️⃣ Připravte buňky do kryovialek s mrazicím médiem. 2️⃣ Umístěte kryovialy do nádoby Mr. Frosty. 3️⃣ Před přenesením do kapalného dusíku uchovávejte při teplotě -80 °C po dobu 24 hodin
? Mraznička s řízenou rychlostí	1️⃣ Naprogramujte zařízení na postupné snižování teploty. 2️⃣ Umístěte připravené buňky do mrazničky. 3️⃣ Po skončení mrazicího cyklu přeneste buňky do tekutého dusíku

Kryovaky skladujte při teplotě nižší než -130 °C nebo v kapalném dusíku pro dlouhodobé uchování.

Materiály a činidla

kryovialky o objemu 1-2 ml
Mrazicí jednotka CoolCell® nebo mraznička s řízenou rychlostí
Kryoprotektivní mrazicí médium (např. kryoprotektivní médium DIY, CM-1, CM-ACF nebo specializovaná média)
Fetální hovězí sérum (FBS) nebo kondicionované médium
DMSO nebo glycerol
PBS bez vápníku a hořčíku
Akutáza, trypsin nebo trypsin-EDTA (pro adherentní buňky)
15 ml nebo 50 ml zkumavky Falcon
Hemocytometr nebo automatické počítadlo buněk
Odstředivka