Vydáno: 2023 | Poslední revize: květen 2026

Komplexní průvodce zmrazováním buněk: zajištění životaschopnosti a sterility

Zmrazování buněk je klíčovým procesem při správě buněčných kultur, který zajišťuje dlouhodobé skladování a uchování cenných buněčných linií. Ať už pracujete s lidskými nebo zvířecími buňkami, dodržování přesných protokolů a přísných aseptických postupů je pro úspěšnou kryokonzervaci zásadní.

Tento průvodce poskytuje podrobné pokyny týkající se nezbytných materiálů, reagencií a postupů krok za krokem pro efektivní zmrazení buněk při zachování jejich životaschopnosti a sterility. Dodržováním těchto pokynů mohou výzkumníci s jistotou skladovat a později oživit buněčné kultury s minimální ztrátou životaschopnosti buněk, čímž zachovají integritu a spolehlivost svých experimentálních výsledků.

Na začátku je nezbytné zajistit sterilní pracovní prostředí. Správné aseptické postupy hrají klíčovou roli při prevenci kontaminace a zajištění sterility kultur.

Aseptická technika

Během celého procesu dodržujte aseptické techniky, abyste zajistili sterilitu kultur.

Komplexní proces zmrazování buněk

Tento vývojový diagram poskytuje podrobného vizuálního průvodce základními kroky správného zmrazování buněk. Dodržujte tyto postupy, abyste zajistili vysokou životaschopnost a integritu buněk během procesu kryokonzervace.

Příprava mrazicího média

Připravte kryoprotektivní mrazicí médium podle typu buněk:

Kultury v médiích obsahujících FBS: 90 % FBS + 10 % DMSO nebo 70 % růstového média, 20 % FBS a 10 % DMSO
Buňky vyžadující glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerolu

Zvažte pořízení našeho předem namíchaného mrazicího média:

Mrazicí médium CM-1: Pro protokoly vyžadující médium obsahující fetální bovinní sérum (FBS)
Mrazicí médium CM-ACF – bez séra: Jako alternativa bez FBS

Označování a dokumentace

Označte kryozkumavky následujícími údaji:

Datum
Jméno výzkumníka
Číslo buněk
Číslo pasáže
Typ buněk
Jakékoli další informace (např. genetické modifikace)

Příprava buněk

Pro adhezivní buňky:

Sledujte buňky, dokud nedosáhnou 85–95% konfluence
Odsajte staré kultivační médium
Opláchněte buněčnou monovrstvu PBS bez vápníku a hořčíku
Oddělte buňky pomocí Accutase, trypsinu nebo trypsinu-EDTA a v případě potřeby neutralizujte kultivačním médiem
Přeneste buněčnou suspenzi do 50ml zkumavky Falcon

Pro buňky v suspenzi:

Zkontrolujte hustotu a stav buněk pod mikroskopem
Přeneste buněčnou suspenzi přímo do 50ml zkumavky Falcon

Počítání buněk a odstředění

Spočítejte buňky pomocí hemocytometru nebo automatického počítadla buněk
Odstřeďte při 300 g po dobu 3–5 minut při pokojové teplotě, aby se buňky usadily
Opatrně odsajte supernatant, aby nedošlo k narušení buněčného peletu
Připravené mrazicí médium před použitím zahřejte na 37 °C

Kryokonzervace

Resuspendujte buněčný sediment v mrazicím médiu na hustotu 2,0 milionu buněk/ml u adhezivních buněk a 5 milionů buněk/ml u suspenzních buněk, případně na požadovanou koncentraci
Odměřte 1,0 ml (nebo více podle potřeby) buněčné suspenze do označených kryozkumavek
Před přenesením buněk do dlouhodobého skladování použijte metodu pomalého zmrazování

? Metoda: ? Kroky
❄️ Ruční zmrazení: 1️⃣ Umístěte buňky v mrazicím médiu do mrazničky při teplotě 4 °C na 40 minut.
2️⃣ Přeneste do mrazničky při teplotě -80 °C na 24 hodin.
3️⃣ Buňky skladujte v tekutém dusíku pro dlouhodobé uchování.
? Použití Mr. Frosty: 1️⃣ Připravte buňky v kryozkumavkách s mrazicím médiem.
2️⃣ Vložte kryozkumavky do nádoby Mr. Frosty.
3️⃣ Skladujte při teplotě -80 °C po dobu 24 hodin před přenesením do tekutého dusíku.
? Mrazák s řízenou rychlostí: 1️⃣ Naprogramujte zařízení tak, aby postupně snižovalo teplotu.
2️⃣ Vložte připravené buňky do mrazničky.
3️⃣ Po skončení mrazicího cyklu přeneste buňky do kapalného dusíku.

Pro dlouhodobé uchování skladujte kryozkumavky při teplotách pod -130 °C nebo v kapalném dusíku.

Materiály a reagencie

1–2 ml kryozkumavky
Mrazicí jednotka CoolCell® nebo mrazák s řízenou rychlostí
Kryoprotektivní mrazicí médium (např. DIY kryoprotektivní média, CM-1, CM-ACF nebo specializovaná média)
Fetální bovinní sérum (FBS) nebo kondicionovaná média
DMSO nebo glycerol
PBS bez vápníku a hořčíku
Accutase, trypsin nebo trypsin-EDTA (pro adhezivní buňky)
15 ml nebo 50 ml zkumavky Falcon
Hemocytometr nebo automatický počítadlo buněk
Centrifuga