Techniky disociace buněčných kultur

Disociace buněčných kultur je kritickým krokem při udržování buněčných kultur. Zahrnuje oddělení buněk od jejich růstového povrchu, aby bylo možné provést subkultivaci nebo sklizeň. Tento oddíl popisuje dvě hlavní metody: použití disociačních pufrů bez enzymů a použití enzymatických činidel.

1.použití bezenzymových buněčných disociačních pufrů

Tato metoda je šetrná a zachovává buněčnou integritu bez použití enzymů:

1. Příprava
   • Před použitím se ujistěte, že jsou všechna činidla zahřátá na 37 °C, aby nedošlo k šoku buněk.
2. Odstranění růstového média
   • Odstraňte staré růstové médium z kultivační nádoby.
3. Oplachování
   • Propláchněte buněčné monovrstvy 5 ml PBS bez vápníku a hořčíku na baňku T75 nebo misku o průměru 100 mm.
   • Nádobu jemně rozkmitejte po dobu 30 až 60 sekund při pokojové teplotě.
   • Oplachovací roztok odsajte a zlikvidujte.
   • Tento oplachovací krok zopakujte ještě jednou.
4. Disociace
   • Do nádobky přidejte přibližně 5 ml disociačního pufru bez enzymů.
   • Jemně houpejte při pokojové teplotě po dobu 1 až 2 minut a zkontrolujte disociaci pod mikroskopem.
   • V případě potřeby klepněte baňkou nebo miskou o ruku, aby se buňky uvolnily.
   • Pokud jsou buňky adherentní, nechte je při pokojové teplotě působit dalších 2 až 5 minut a v případě potřeby s nimi znovu poklepejte a použijte více disociačního pufru.
   • Jakmile jsou buňky odděleny, přidejte alespoň 5 ml kompletního růstového média, abyste neutralizovali disociační pufr a buňky znovu suspendovali.
5. Kontrola životaschopnosti
   • Během subkultivace sledujte životaschopnost buněk a zajistěte, aby zůstala nad 90 %.

2.použití dalších činidel pro disociaci

Tato metoda umožňuje použití různých disociačních činidel:

1. Odstranění použitého média
   • Vyhoďte staré médium z kultivační nádoby.
2. Promývání buněk
   • Buňky promyjte vyváženým roztokem soli bez vápníku a hořčíku nebo použijte EDTA.
   • Promývací roztok opatrně přidejte na stranu naproti buňkám a před vylitím promývacího roztoku nádobou 1 až 2 minuty pohupujte.
3. Disociace
   • Naneste 2 až 3 ml zvoleného disociačního roztoku na 25 cm² růstového povrchu a zajistěte pokrytí buněčného listu.
   • Inkubujte nádobu při teplotě 37 °C a jemně s ní pohupujte. Disociace obvykle probíhá během 5 až 15 minut v závislosti na buněčné linii.
   • U odolných buněk může poklepání na nádobu proces urychlit.
   • Buňky pečlivě sledujte, aby nedošlo k jejich nadměrné expozici a případnému poškození.
4. Sklízení buněk
   • Jakmile jsou buňky zcela odděleny, nechte je shromáždit na dně nádoby tak, že ji postavíte do svislé polohy.
   • Přidejte kompletní médium, poté buňky rozptýlíte a seberete pipetou nad vrstvou buněk.
   • Spočítejte je a pokračujte v subkultivaci.

U obou metod je důležité určit optimální podmínky pro každou buněčnou linii empirickým pozorováním. Postup by měl zachovat životaschopnost buněk, která by měla být během subkultivace rutinně kontrolována tak, aby přesahovala 90 %. Tyto postupy poskytují výzkumným pracovníkům základ, který mohou přizpůsobit na základě specifických požadavků a vlastností svých buněčných linií.

3.přehled technik pro subkultivaci adherentních buněk

Účinná subkultivace adherentních buněk vyžaduje jejich oddělení od kultivační nádoby. Používají se různé metody, z nichž každá je vhodná pro různé typy buněk a podmínky. Při výběru metody oddělování je zásadní zvážit specifické potřeby buněčné linie a cíle experimentu. Pravidelné sledování životaschopnosti buněk, s cílem dosáhnout více než 90 % v době subkultivace, je nezbytné pro zachování zdraví a produktivity kultury. Zde je přehled těchto postupů: