Vydáno: 2023 | Poslední revize: květen 2026

Techniky disociace buněčných kultur

Disociace buněčné kultury je klíčovým krokem při udržování buněčné kultury. Zahrnuje oddělení buněk od povrchu, na kterém rostou, aby bylo možné provést subkultivaci nebo sklizeň. Tato část popisuje dvě hlavní metody: použití disociačních pufrů bez enzymů a použití enzymatických činidel.

Použití bezenzymových pufrů pro disociaci buněk

Tato metoda je šetrná a zachovává integritu buněk bez použití enzymů:

1. Příprava
   • Před použitím se ujistěte, že jsou všechna činidla zahřátá na 37 °C, aby nedošlo k šoku buněk.
2. Odstranění růstového média:
   • Vylijte staré růstové médium z kultivační nádoby.
3. Opláchnutí
   • Opláchněte buněčné monovrstvy 5 ml PBS bez vápníku a hořčíku na každou baňku T75 nebo misku o průměru 100 mm.
   • Nádobu jemně protřepávejte po dobu 30 až 60 sekund při pokojové teplotě.
   • Oplachový roztok odsajte a zlikvidujte.
   • Tento krok oplachování zopakujte ještě jednou.
4. Disociace
   • Do nádoby přidejte přibližně 5 ml pufru pro disociaci buněk bez enzymů.
   • Jemně protřepávejte při pokojové teplotě po dobu 1 až 2 minut a zkontrolujte disociaci pod mikroskopem.
   • V případě potřeby poklepejte na baňku nebo misku o dlaň, aby se buňky uvolnily.
   • Pokud buňky ulpívají, nechte je stát při pokojové teplotě dalších 2 až 5 minut a v případě potřeby znovu poklepejte, přičemž použijte více disociačního pufru.
   • Jakmile se buňky uvolní, přidejte alespoň 5 ml kompletního růstového média, abyste neutralizovali disociační pufr a resuspendovali buňky.
5. Kontrola životaschopnosti
   • Během subkultivace sledujte životaschopnost buněk a zajistěte, aby zůstala nad 90 %.

Použití jiných činidel pro disociaci

Tato metoda umožňuje použití různých disociačních činidel:

1. Odstranění použitého média
   • Z kultivační nádoby vylijte staré médium.
2. Promývání buněk
   • Buňky promyjte vyváženým solným roztokem bez vápníku a hořčíku nebo použijte EDTA.
   • Opatrně přidejte promývací roztok na stranu naproti buňkám a nádobu 1 až 2 minuty protřepávejte, než promývací roztok vylijete.
3. Disociace
   • Naneste 2 až 3 ml zvoleného disociačního roztoku na 25 cm² růstové plochy a zajistěte pokrytí buněčného vrstvy.
   • Nádobu inkubujte při teplotě 37 °C a jemně s ní pohupujte. K disociaci obvykle dojde během 5 až 15 minut, v závislosti na buněčné linii.
   • U odolných buněk lze proces urychlit poklepáním na nádobu.
   • Buňky pečlivě sledujte, abyste zabránili jejich nadměrnému vystavení a možnému poškození.
4. Sběr buněk
   • Jakmile jsou buňky zcela odloučeny, nechte je usadit na dně nádoby tím, že ji postavíte do svislé polohy.
   • Přidejte kompletní médium, poté buňky rozptylte a odeberte pipetováním nad buněčnou vrstvou.
   • Spočítejte buňky a pokračujte v subkultivaci.

U obou metod je důležité určit optimální podmínky pro každou buněčnou linii na základě empirického pozorování. Proces by měl zachovat životaschopnost buněk, která by měla být během subkultivace pravidelně kontrolována a měla by přesahovat 90 %. Tyto postupy poskytují výzkumníkům základ, který mohou přizpůsobit na základě specifických požadavků a charakteristik svých buněčných linií.

Přehled technik subkultivace adhezivních buněk

Účinné subkultivování adhezivních buněk vyžaduje jejich odloučení od kultivační nádoby. Používají se různé metody, z nichž každá je vhodná pro různé typy buněk a podmínky. Při výběru metody disociace je zásadní zohlednit specifické potřeby buněčné linie a cíle experimentu. Pravidelné sledování životaschopnosti buněk s cílem dosáhnout více než 90 % v době subkultivace je nezbytné pro zachování zdraví a produktivity kultury. Zde je přehled těchto postupů: