Vydáno: 2023 | Poslední revize: květen 2026

Buňky HEK293: Základní kámen moderního buněčného výzkumu a biotechnologie

Buňky lidské embryonální ledviny 293 (HEK293) jsou buněčnou linií lidské embryonální ledviny, která si v vědecké komunitě získala širokou popularitu díky své univerzálnosti a užitečnosti v celé řadě výzkumných aplikací. Tato buněčná linie byla založena na počátku 70. let 20. století a od té doby se používá pro vývoj vakcín, výzkum rakoviny, testování léčiv a signální transdukci. Tento blogový příspěvek se bude zabývat všemi aspekty buněčné linie HEK293, včetně jejího původu, informací o kultivaci, výhod a nevýhod, aplikací a zdrojů.

Buňky HEK293: obecné informace a původ

Co jsou buňky HEK293?

Buňky HEK293 jsou lidská embryonální renální buněčná linie odvozená z renální tkáně lidského embrya neznámého původu, které bylo potraceno z volby. Buňky byly založeny nizozemským biologem Alexem Van der Ebem na počátku 70. let 20. století. Později byly imortalizovány transformací zkráceným adenovirem 5 výzkumníkem Frankem Grahamem.

Zpočátku se transformace těchto buněk jevila jako náročná. Po mnoha nepřetržitých snahách však došlo k buněčnému růstu z izolovaného jediného transformovaného klonu [1]. Transfekce buněk adenovirem 5 vedla k začlenění genů E1A a E1B do genomu buněk, což zabraňuje buněčné smrti a umožňuje hojnou produkci proteinů. Před imortalizací nebyly fetální ledvinové buňky dostatečně charakterizovány, takže jejich přesný buněčný typ není znám.

Embryonální ledviny se skládají z endoteliálních, epiteliálních a fibroblastových buněk, takže buňky HEK 293 pravděpodobně patří k těmto buňkám. mRNA a genové produkty však naznačují, že se jedná o neuronální buňky. Je možné, že přidání Ad5 změnilo buněčný fenotyp a genovou expresi. Zajímavost: Číslo „293“ v označení HEK293 odkazuje na 293. experiment provedený Grahamem.

Zajímavost: Číslo „293“ v označení HEK293 odkazuje na 293. experiment provedený Grahamem.

Vlastnosti buněk HEK293

• Morfologie
• Velikost buněk
• Genom a ploidií (počet chromozomů)

Buňky HEK293 mají tvar připomínající epitelové buňky. Embryonální ledviny se skládají hlavně z fibroblastů, endoteliálních a epitelových buněk. Buňky 293 se tedy tvarem podobají jednomu z těchto buněčných typů.

Velikost buněk HEK 293 se pohybuje v rozmezí 11 až 15 µm, což může být ovlivněno kultivačními podmínkami. V kultuře mohou buňky vypadat zploštělé, jsou-li pěstovány na povrchu, nebo zaoblené v suspenzi. Buňky HEK293 jsou hypotriploidní a přibližně 30 % buněk HEK293 má modální ploidii 64 chromozomů, ale některé buňky mají i více chromozomů. Buňky mají také tři kopie chromozomu X a fragment adenoviru 5 o velikosti 4 kilobázových párů integrovaný do chromozomu 19.

Srovnání buněčných linií HEK293 a HEK293T

Z původních buněk HEK 293 bylo odvozeno mnoho derivátů, jako jsou běžné deriváty buněk 293, HEK293T a HEK293F. Buňky HEK293T jsou jedním z nejčastěji používaných derivátů a byly vytvořeny začleněním teplotně citlivé mutace T-antigenu SV40 do původního genomu buněk HEK 293. Exprese T-antigenu umožňuje replikaci plazmidů s replikačním počátkem SV40 při transfekci do buněk 293-T, což vede ke zvýšené produkci rekombinantních proteinů [2]. Více informací o derivátech buněčné linie HEK, včetně jejich vývoje a charakteristik, naleznete v tomto přehledovém článku.

Základy kultivace buněk HEK293: Průvodce krok za krokem

Podmínky

Informace

Doba zdvojnásobení populace

Doba zdvojnásobení buněčné linie HEK293 se pohybuje v rozmezí 24 až 45 hodin, přičemž průměr činí 30 hodin.

Adhezivní nebo suspenzní kultury

Buňky HEK293 lze pěstovat jak v adhezivní, tak v suspenzní formě. Adhezivní buňky rostou jako monovrstvy, zatímco suspenzní kultury rostou jako sféroidy.

Hustota výsevu

Během růstové fáze rozdělte buňky při 80–90% konfluenci. Buňky oddělte pomocí Accutase a naočkujte v hustotě 1 až 4 x 104 buněk/cm2. Při hustotě naočkování 1 x 104 buněk/cm2 se za 4 dny vytvoří konfluentní vrstva.

Růstové médium

Pěstujte v Eagleově minimálním esenciálním médiu (EMEM) s 2 mM L-glutaminem a 10 % fetálního bovinního séra (FBS). Médium vyměňujte dvakrát týdně.

Podmínky růstu (teplota, CO2)

Pro optimální růst udržujte v zvlhčeném inkubátoru při teplotě 37 °C s přívodem 5 % CO2.

Skladování

Pro dlouhodobé uchování skladujte v plynné nebo kapalné fázi kapalného dusíku. Vyhněte se skladování v mrazáku při teplotě -80 °C, protože by to mohlo ovlivnit životaschopnost buněk.

Proces zmrazování a médium

Pro nejlepší uchování použijte metodu pomalého zmrazování. Zmrazujte v mrazicím médiu CM-1 nebo CM-ACF, které je k dispozici u společnosti CLS.

Proces rozmrazování

Zmrazené buňky rozmrazujte ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 1–2 minut, dokud nezůstane malá hrudka ledu. Přeneste buněčnou suspenzi do odstředivkové zkumavky, přidejte předehřáté růstové médium a odstřeďte, aby se odstranily složky mrazicího média. Buněčný pelet resuspendujte v čerstvém médiu a kultivujte za optimálních podmínek.

Úroveň biologické bezpečnosti

S buňkami HEK293 je třeba zacházet na úrovni biologické bezpečnosti 1.

Pořiďte si buňky HEK293 pro své výzkumné projekty

Pro svůj průkopnický výzkum zvažte naše buňky HEK293, známé svou univerzálností ve studiích genové exprese a vývoji vakcín, a jejich deriváty, jako jsou HEK293T, HEK293 adaptované na suspenzi, HEK293T/17, AAV-293 a 2V6.11. Zjistěte více a vylepšete své experimenty prozkoumáním naší produktové řady zde.

Buněčná linie HEK293 ve výzkumu a průmyslu

Využití buněk HEK293 je rozmanité a významné. Často se používají jako systém pro expresi a produkci rekombinantních proteinů. Vzhledem k jejich lidskému původu je pravděpodobnější, že proteiny produkované v těchto buňkách budou z hlediska struktury a funkce podobné svým přirozeným lidským protějškům, což je pro terapeutické aplikace zásadní.

Kromě toho se buňky HEK293 často používají při studiu funkce a regulace genů, protože snadno přijímají cizí DNA, což z nich činí vynikající model pro genetickou manipulaci. Tyto buňky také hrají klíčovou roli při výrobě adenovirových vektorů, které se používají v genové terapii a vývoji vakcín, včetně rychlého vytváření vakcín proti COVID-19.

Výroba vakcín a proteinů: Buňky HEK 293 jsou vhodné pro velkovýrobu proteinů a terapeutických vakcín. Tato buněčná linie se dále používá k výrobě virových vektorů, jako jsou adenoasociované a adenovirové vektory. V poslední době se buňky HEK293 používají k produkci klíčového rekombinantního proteinu, erytropoetinu (EPO).

Testování léčiv: Buňky HEK293 se často používají k testování toxicity léčiv a přírodních produktů.

Výzkum rakoviny: Buňky 293 jsou tumorigenní a zásadní změny v genové expresi mohou v této buněčné linii zhoršit tumorigenesi. Proto se buněčná linie 293 často používá ve studiích rakoviny k pochopení základních molekulárních mechanismů a vývoji léků.

Studie transfekce: Transfekce je proces zavádění nukleových kyselin do buněk a buňky HEK293 jsou pro tento proces obzvláště vhodné. Více o tomto tématu je vysvětleno níže.

Úloha HEK293 při výrobě vakcín a proteinů

Při výrobě vakcín hrály buňky HEK293 klíčovou roli při vývoji vakcín na bázi adenovirů. Jejich schopnost růst v suspenzních kulturách umožňuje škálovatelné procesy, které jsou zásadní pro uspokojení globální poptávky po vakcínách. Kromě toho jejich lidský původ představuje výhodu oproti jiným buněčným liniím, protože mohou provádět posttranslační modifikace podobné lidským, což zajišťuje biologickou účinnost vyráběných vakcín.

Všestrannost buněk HEK293 sahá až k výrobě komplexních proteinů, včetně monoklonálních protilátek a biosimilars, které se používají při léčbě rakoviny, autoimunitních onemocnění a dalších stavů. Jejich schopnost přesně skládat a modifikovat proteiny z nich činí preferovanou volbu v odvětví výroby rekombinantních proteinů.

Proč se buňky HEK293 používají k transfekci?

Transfekce je proces zavádění nukleových kyselin do buněk a buňky HEK293 jsou pro tento proces obzvláště vhodné. Existuje několik důvodů, proč jsou buňky HEK293 pro transfekci preferovány:

1. Vysoká účinnost transfekce: Buňky HEK293 mají vysokou míru příjmu cizí DNA, což lze připsat jejich schopnosti exprimovat určité virové geny, které usnadňují vstup DNA do buňky.
2. Robustní růst: Tyto buňky rostou rychle a jejich kultivace je relativně snadná, což je výhodné pro experimenty, které vyžadují rychlé a spolehlivé výsledky.
3. Přizpůsobivost: Buňky HEK293 lze pěstovat v různých podmínkách, včetně adhezivních nebo suspenzních kultur, což je činí vhodnými pro velkovýrobu proteinů.
4. Lidská buněčná linie: Jako lidská buněčná linie poskytují relevantnější biologický kontext pro lidskou biologii, což je zvláště důležité v terapeutickém výzkumu, kde reakce v lidských buňkách předpovídá výsledky in vivo.
5. Všestrannost: Jsou schopny produkovat proteiny se složitými posttranslačními modifikacemi, což je vlastnost nezbytná pro funkčnost mnoha proteinů, zejména terapeutických protilátek. 

Protokol subkultivace HEK293

Potřebné reagencie

1. 1X fosfátový pufr (PBS)
2. 10% trypsin-PBS
3. Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM)

Postup

Příprava buněk

1. Zkontrolujte HEK buňky pod mikroskopem, abyste se ujistili, že jsou asi z 90 % konfluentní.
2. Vyčistěte pracovní stanici pomocí aseptických technik a sterilizujte digestoř UV světlem.
3. Pracovní plochu otřete 70% etanolem.
4. Všechny reagencie předehřejte ve vodní lázni o teplotě 37 °C.

Výpočet frakce rozdělení a množství výsevu

1. Určete rozdělenou frakci, obvykle v poměru 1:5 až 1:20.
2. Vypočítejte objem pro pipetování pomocí vzorce: Vp = (S)(Vd).

Objemy médií a protokoly rozdělení

Pro buněčnou kulturu vyžadují různé nádoby specifické objemy média a mají jedinečné růstové plochy. Například 6jamková destička má růstovou plochu 4,67 cm^2 na jamku a vyžaduje asi 2,5 ml média, zatímco 100mm destička má růstovou plochu 55 cm^2 a vyžaduje 10 ml média. Proces dělení buněk zahrnuje odstranění starého média, promytí PBS, inkubaci s Accutase, neutralizaci DMEM, odstředění, resuspendování v novém médiu a následné naočkování na novou destičku. Podrobné kroky a poměry pro jiné nádoby, jako jsou 100 cm² baňky a 150 mm destičky, naleznete v původním zdroji.

Často kladené otázky o buňkách HEK293

Buňky HEK293 jsou předmětem širokého využití ve vědeckém výzkumu, což přirozeně vyvolává řadu otázek o jejich povaze, původu a vlastnostech. Níže se zabýváme některými z těchto častých dotazů.