الدليل الشامل لتجميد الخلايا: ضمان الصلاحية والعقم

يعد تجميد الخلايا عملية بالغة الأهمية في إدارة مزارع الخلايا، مما يضمن تخزين خطوط الخلايا القيمة وحفظها على المدى الطويل. وسواء كان العمل مع خلايا بشرية أو حيوانية، فإن اتباع بروتوكولات دقيقة والحفاظ على تقنيات معقمة صارمة أمر بالغ الأهمية لتحقيق الحفظ بالتبريد الناجح.

يوفر هذا الدليل إرشادات مفصلة حول المواد والكواشف والإجراءات اللازمة خطوة بخطوة لتجميد الخلايا بفعالية مع الحفاظ على حيويتها وعقمها. من خلال الالتزام بهذه الإرشادات، يمكن للباحثين تخزين مزارع الخلايا وإحيائها لاحقًا بثقة مع الحد الأدنى من فقدان صلاحية الخلايا، والحفاظ على سلامة وموثوقية نتائج تجاربهم.

في البداية، من الضروري إنشاء بيئة عمل معقمة. تلعب التقنيات المعقمة المناسبة دورًا حاسمًا في منع التلوث وضمان عقم المستنبتات.

تقنية التعقيم

اتبع تقنيات التعقيم طوال العملية لضمان تعقيم المستنبتات.

عملية التجميد الشامل للخلية

يوفر هذا المخطط الانسيابي دليلاً مرئياً مفصلاً للخطوات الأساسية المتبعة في التجميد السليم للخلايا. اتبع هذه الإجراءات لضمان حيوية وسلامة عالية للخلايا أثناء عملية الحفظ بالتبريد.

تحضير وسط التجميد

تحضير وسط التجميد بالتبريد وفقًا لنوع الخلية:

مزارع الوسائط المحتوية على FBS: 90% FBS + 10% DMSO أو 70% وسط نمو، و20% FBS و10% DMSO
الخلايا التي تحتاج إلى الجلسرين: 90% FBS + 10% جلسرين: 90% FBS + 10% جلسرين

ضع في اعتبارك الحصول على وسط التجميد المُعد مسبقاً:

وسط التجميد CM-1: للبروتوكولات التي تتطلب وسطًا يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS)
وسيط التجميد CM-ACF - خالٍ من المصل: لبديل خالٍ من FBS

التوسيم والتوثيق

قم بتسمية قوارير التجميد بالتفاصيل التالية:

التاريخ
اسم الباحث
رقم الخلية
رقم الممر
نوع الخلية
أي معلومات إضافية (مثل التعديلات الجينية)

تحضير الخلية

للخلايا الملتصقة:

مراقبة الخلايا حتى تصل إلى نسبة 85-95% من التماسك
شفط وسط المستنبت القديم
شطف الطبقة الأحادية الخلوية باستخدام PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم
فصل الخلايا باستخدام أكوتاز، أو التربسين، أو التربسين-إيدتا، وتحييدها بوسط المستنبت إذا لزم الأمر
نقل معلق الخلية إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل

للخلايا المعلقة

التحقق من كثافة الخلايا وصحتها تحت المجهر
نقل معلق الخلية مباشرةً إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل

عد الخلايا والطرد المركزي

عدّ الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي
جهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا
شفط المادة الطافية بعناية، مع تجنب تشويش كريات الخلايا
تسخين وسائط التجميد المحضرة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام

الحفظ بالتبريد

إعادة تعليق كريات الخلايا في وسائط التجميد بكثافة 2.0 مليون خلية/ملل للخلايا الملتصقة و5 مليون خلية/ملل للخلايا المعلقة أو التركيز المطلوب
قم بتفريغ 1.0 مل (أو أكثر حسب الحاجة) من معلق الخلية في قوارير مبردة تحمل علامة
استخدام طريقة التجميد البطيء قبل نقل الخلايا إلى التخزين طويل الأجل

? الطريقة	? الخطوات
❄️ التجميد اليدوي	1️⃣ ضع الخلايا في وسط التجميد في مُجمِّد بدرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 40 دقيقة. 2️⃣ نقل إلى مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 3️⃣ تخزين الخلايا في النيتروجين السائل لحفظها على المدى الطويل
? استخدام السيد فروستي	1️⃣ تحضير الخلايا في قوارير التجميد بوسط التجميد. 2️⃣ ضع قوارير التجميد في حاوية السيد فروستي. 3️⃣ تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة قبل نقلها إلى النيتروجين السائل
? المجمد ذو المعدل المتحكم فيه	1️⃣ برمجة الجهاز لخفض درجة الحرارة تدريجياً. 2️⃣ ضع الخلايا المحضرة في المجمد. 3️⃣ بعد دورة التجميد، انقل الخلايا إلى النيتروجين السائل

قم بتخزين القوارير المبردة في درجة حرارة أقل من -130 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل لحفظها على المدى الطويل.

المواد والكواشف

قوارير تبريد سعة 1-2 مل
وحدة التجميد CoolCell® CoolCell أو المجمد ذو المعدل المتحكم فيه
وسيط التجميد الواقي بالتبريد (مثل وسائط التجميد بالتبريد الذاتي أو CM-1 أو CM-ACF أو الوسائط المتخصصة)
مصل بقري جنيني (FBS) أو وسائط مكيفة
DMSO أو الجلسرين
PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم
أكوتاز أو تريبسين أو تريبسين-إيدتا (للخلايا الملتصقة)
أنابيب فالكون سعة 15 مل أو 50 مل
مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي
جهاز طرد مركزي