تاريخ النشر: 2023 | تاريخ آخر مراجعة: مايو 2026
دليل شامل لتجميد الخلايا: ضمان قابلية البقاء على قيد الحياة والتعقيم
يعد تجميد الخلايا عملية حاسمة في إدارة زراعة الخلايا، حيث يضمن التخزين والحفظ طويل الأمد لخطوط الخلايا القيمة. وسواء كان العمل مع خلايا بشرية أو حيوانية، فإن اتباع بروتوكولات دقيقة والحفاظ على تقنيات تعقيم صارمة أمر بالغ الأهمية لتحقيق الحفظ بالتبريد بنجاح.
يقدم هذا الدليل إرشادات مفصلة حول المواد والكواشف اللازمة والإجراءات التفصيلية لتجميد الخلايا بفعالية مع الحفاظ على قابليتها للحياة وتعقيمها. من خلال الالتزام بهذه الإرشادات، يمكن للباحثين تخزين مزارع الخلايا وإحيائها لاحقًا بثقة مع الحد الأدنى من الخسارة في قابلية الخلايا للحياة، مما يحافظ على سلامة وموثوقية نتائج تجاربهم.
للبدء، من الضروري تهيئة بيئة عمل معقمة. تلعب تقنيات التعقيم المناسبة دورًا حاسمًا في منع التلوث وضمان تعقيم المزارع.
تقنية التعقيم
اتبع تقنيات التعقيم طوال العملية لضمان تعقيم المزارع.
عملية تجميد الخلايا الشاملة
يقدم هذا المخطط البياني دليلاً مرئياً مفصلاً للخطوات الأساسية التي ينطوي عليها التجميد السليم للخلايا. اتبع هذه الإجراءات لضمان قابلية الخلايا العالية للحياة وسلامتها أثناء عملية الحفظ بالتبريد.
تحضير وسط التجميد
قم بإعداد وسط التجميد الواقي من الصقيع وفقًا لنوع الخلية:
- مزارع الوسائط المحتوية على FBS: 90٪ FBS + 10٪ DMSO أو 70٪ وسط نمو، 20٪ FBS و 10٪ DMSO
- الخلايا التي تتطلب الجلسرين: 90٪ FBS + 10٪ جلسرين
فكر في شراء وسط التجميد الجاهز الخاص بنا:
- وسط التجميد CM-1: للبروتوكولات التي تتطلب وسطًا يحتوي على مصل الأبقار الجنينية (FBS)
- وسط التجميد CM-ACF - خالٍ من المصل: كبديل خالٍ من FBS
الوسم والتوثيق
قم بوضع ملصقات على أنابيب التجميد تتضمن التفاصيل التالية:
- التاريخ
- اسم الباحث
- رقم الخلية
- رقم التمرير
- نوع الخلية
- أي معلومات إضافية (مثل التعديلات الجينية)
تحضير الخلايا
بالنسبة للخلايا الملتصقة:
- مراقبة الخلايا حتى تصل إلى نسبة تراكب تتراوح بين 85 و95%
- شفط وسط الاستزراع القديم
- شطف الطبقة الأحادية للخلايا بمحلول PBS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم
- افصل الخلايا باستخدام Accutase أو التربسين أو التربسين-EDTA وقم بتحييدها باستخدام وسط الاستزراع إذا لزم الأمر
- انقل معلق الخلايا إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل
بالنسبة للخلايا المعلقة:
- تحقق من كثافة الخلايا وصحتها تحت المجهر
- انقل معلق الخلايا مباشرة إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل
عد الخلايا والطرد المركزي
- قم بعد الخلايا باستخدام عداد خلايا الدم أو عداد الخلايا الآلي
- قم بالطرد المركزي عند 300 جرام لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا
- قم بشفط الطبقة العائمة بعناية، مع تجنب إزعاج رواسب الخلايا
- قم بتسخين وسط التجميد المُعد إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام
الحفظ بالتبريد
- أعد تعليق رواسب الخلايا في وسيط التجميد حتى تصل الكثافة إلى 2.0 مليون خلية/مل للخلايا الملتصقة، و5 ملايين خلية/مل للخلايا المعلقة، أو التركيز الذي تريده
- قسّم 1.0 مل (أو أكثر حسب الحاجة) من معلق الخلايا إلى أنابيب تجميد موصوفة
- استخدم طريقة التجميد البطيء قبل نقل الخلايا إلى التخزين طويل الأمد
- ? الطريقة
- ? الخطوات
-
❄️
التجميد اليدوي -
1️⃣ ضع الخلايا في وسط التجميد في مجمد بدرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 40 دقيقة.
2️⃣ انقلها إلى مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
3️⃣ خزن الخلايا في النيتروجين السائل للحفظ طويل الأمد. -
?
استخدام Mr. Frosty -
1️⃣ قم بإعداد الخلايا في أنابيب التجميد باستخدام وسط التجميد.
2️⃣ ضع أنابيب التجميد في حاوية Mr. Frosty.
3️⃣ قم بالتخزين عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقلها إلى النيتروجين السائل. -
?
مجمد بمعدل تحكم -
1️⃣ برمج الجهاز لخفض درجة الحرارة تدريجيًا.
2️⃣ ضع الخلايا المعدة في المجمد.
3️⃣ بعد دورة التجميد، انقل الخلايا إلى النيتروجين السائل.
- قم بتخزين أنابيب التجميد عند درجات حرارة أقل من -130 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل للحفظ طويل الأمد.
المواد والمواد الكيميائية
- أنابيب تجميد سعة 1-2 مل
- وحدة تجميد CoolCell® أو مجمد ذو معدل تحكم
- وسط تجميد واقي من الصقيع (على سبيل المثال، وسائط واقية من الصقيع مصنوعة يدويًا، أو CM-1، أو CM-ACF، أو وسائط متخصصة)
- مصل جنيني بقري (FBS) أو وسائط مُعدلة
- DMSO أو الجلسرين
- PBS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم
- Accutase أو Trypsin أو Trypsin-EDTA (للخلايا الملتصقة)
- أنابيب فالكون سعة 15 مل أو 50 مل
- مقياس خلايا الدم أو عداد الخلايا الآلي
- جهاز طرد مركزي