细胞培养基：概述

在生命科学领域，细胞培养是最重要的方法之一。所谓“细胞培养”，是指从动物或植物体内取出细胞、组织或器官，随后将其移植到有利于其存活和/或生长的人工环境中。 细胞最佳发育的基本环境需求包括：受控的温度、供细胞附着的基质、适宜的培养基，以及能够维持最佳pH值和渗透压的培养箱。细胞必须具备这些条件，才能充分发挥其生长潜力。

为体外培养选择合适的生长培养基，是细胞培养过程中既最为关键又最为重要的环节。 培养基（也称为培养液）是一种经过配制的液体或凝胶，旨在促进微生物、细胞或植物等生物体的发育。用于培养细胞的培养基通常含有充足的能量以及调控细胞周期的物质。 培养基的主要成分包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和血清。向培养基中添加血清是因为它能作为生长因子、激素和附着因子的来源。除了提供营养外，培养基还有助于维持pH值和渗透压水平。

细胞培养中使用的培养基类型

无论是人类细胞还是动物细胞，均可在人工或合成培养基中培养，也可在补充了天然成分的完全天然培养基中培养。下文将为您概述目前可用的不同培养基类型。

天然培养基

天然培养基中仅含有处于自然状态的生物体液。对于培养多种动物细胞类型而言，天然培养基非常有用且操作简便。由于对构成天然培养基的确切成分缺乏了解，这是导致使用天然培养基获得的结果重复性较低的主要因素。

人工培养基

人工或合成培养基的制备涉及添加营养物质（包括有机和无机）、血清蛋白、碳水化合物、辅因子、维生素和盐类，以及O₂和CO₂气相成分[1]。

为了实现以下一项或多项功能，已开发出多种类型的人工培养基：1) 即时存活（pH值和渗透压精确控制的平衡盐溶液）。2) 长期存活（在平衡盐溶液中添加不同配方的有机化学物质和/或血清）。 3) 无限期发育。4) 特殊功能。

人工培养基有四种不同的分类：

含血清培养基

在动物细胞培养基中，最常见的补充成分是胎牛血清。将其作为低成本的补充剂加入培养基中，旨在创造最佳的生长条件。 除了作为不稳定或水不溶性营养物质、激素和生长因子、蛋白酶抑制剂及其他物质的转运载体或螯合剂外，血清还能结合并中和有害分子。

无血清培养基

培养基中血清的存在存在诸多弊端，并可能导致免疫学研究中出现重大解读误差[2, 3]。目前已开发出多种不同的无血清培养基[4, 5]。 这些培养基通常经过专门配制，以支持单一细胞类型的培养，例如赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）的“Knockout Serum Replacement”和“Knockout DMEM”，以及干细胞技术公司（Stem Cell Technologies）专为干细胞设计的mTESR培养基[6][7]。

此外，这些培养基中还添加了定量的纯化生长因子、脂蛋白及其他蛋白质，这些成分通常由血清提供[8]。由于这些培养基的组成成分已得到充分了解，因此常被称为“定义型培养基”。

化学定义培养基

这些培养基包含未受任何污染的超纯无机和有机成分。它们还可能包含纯蛋白质添加物，例如生长因子。

 通过对细菌或酵母进行基因改造，并添加特定的脂肪酸、维生素、胆固醇和氨基酸，即可制备出这些培养基的组成成分[9]。

无蛋白培养基

无蛋白培养基是指完全不含任何蛋白质，仅包含非蛋白质成分的培养基。与添加血清的培养基相比，使用未添加蛋白质的培养基能促进更强的细胞增殖和蛋白质表达，并使下游工艺中产生的任何产物更易于纯化 [10-12]。 MEM和RPMI-1640等培养基配方中不含蛋白质。但在必要时，可添加蛋白质补充剂。

培养基及其基本成分

市售培养基可购买为粉末或液体形式，通常包含多种营养成分，如氨基酸、葡萄糖、盐类、维生素及其他营养补充剂。 

不同细胞系对这些成分的需求各不相同，正是这些差异导致了培养基配方种类繁多。每种成分都承担着特定的功能，下文将对此进行概述：

缓冲系统

为维持最佳生长条件，必须控制pH值，这通常通过以下两种缓冲系统之一来实现：

天然缓冲系统

大气中的二氧化碳（CO₂）与碳酸（H₂CO₃）比例与培养基中的比例相等，从而形成一种天然缓冲机制。为了保留这种天然缓冲机制，培养物必须置于二氧化碳浓度为5%-10%的空气环境中，这通常通过使用二氧化碳培养箱来实现。 使用天然缓冲系统的最大优势之一在于其成本低廉且安全可靠。

HEPES

利用两性离子HEPES进行的化学缓冲在pH值7.2-7.4范围内具有更强的缓冲能力，且无需调节气体环境。对于特定类型的细胞，过量的HEPES可能具有毒性。 同样，含有HEPES的培养基也更容易受到荧光灯的光毒性影响 [13]。

酚红

pH指示剂酚红常被添加到市售培养基中，以便持续监测pH值。随着细胞增殖，细胞产生的代谢物会导致pH值发生变化，从而引起培养基颜色的变化。 酚红对培养基颜色具有双重作用：在酸性pH值下呈黄色，在碱性pH值下呈紫色。pH 7.4（细胞培养的最佳值）会使培养基呈现荧光红色。

但酚红也存在一些缺点：首先，酚红能够模拟多种类固醇激素（主要是雌激素）的作用[14]。因此，在研究乳腺组织等对雌激素敏感的细胞时，建议使用不含酚红的培养基。 在某些无血清培养基配方中，酚红的存在会破坏钠-钾平衡。向培养基中添加血清或牛垂体激素可抵消这一影响[15]。第三，酚红的存在会妨碍流式细胞术实验中的检测。

无机盐

含有无机盐（如钠、钾和钙离子）的培养基有助于维持渗透平衡并调节膜电位。

氨基酸

由于氨基酸是蛋白质的基本组成单位，因此它们是迄今为止所有已知的细胞培养基中不可或缺的成分。由于细胞无法自行合成某些氨基酸，因此培养基中必须包含必需氨基酸。 这些氨基酸对细胞增殖必不可少，其浓度决定了可达到的最高细胞密度。其中，必需氨基酸L-谷氨酰胺尤为关键。

L-谷氨酰胺作为代谢的次要能量来源，并为NAD、NADPH和核苷酸的合成提供氮源。由于L-谷氨酰胺是一种不稳定的氨基酸，随时间推移会转化为细胞无法利用的形式，因此必须将其添加到培养基中。

此外，可向培养基中添加非必需氨基酸，以补充生长过程中消耗的氨基酸。当培养基中补充非必需氨基酸时，细胞的生长会得到促进，其存活率也会提高。

碳水化合物

以糖类形式存在的碳水化合物是主要的能量来源。除葡萄糖和半乳糖等常见糖类外，许多培养基中还含有麦芽糖和果糖。

蛋白质和肽

白蛋白、转铁蛋白和纤维连接蛋白是最常用的蛋白质和肽。它们在不含血清的培养基中尤为重要。血清是蛋白质的丰富来源，其中可能包含白蛋白、转铁蛋白、阿普罗丁、胎蛋白和纤维连接蛋白等蛋白质。

白蛋白是血液中的主要蛋白质，其功能是在不同器官和细胞之间结合并运输各种物质，包括水、盐类、游离脂肪酸、激素和维生素。白蛋白与化学物质结合的能力使其成为从细胞培养基中去除有害化合物的有效选择。

阿普罗替宁是细胞培养系统中的保护剂，因为它在中性及酸性pH值条件下均保持稳定，且能耐受高温以及蛋白水解酶可能造成的破坏。它能够抑制多种丝氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶等。

胎蛋白（Fetuin）是一种糖蛋白，在动物胎儿和新生儿的血清中检测到的含量通常高于成年动物血清。此外，它还具有丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用。纤维连接蛋白（Fibronectin）是细胞粘附过程中不可或缺的组成部分。 转铁蛋白是一种负责运输铁并将其输送至细胞膜的蛋白质。

脂肪酸和脂质

在无血清培养基中，当缺乏血清时，它们起着至关重要的作用。

维生素

多种维生素对细胞的发育和增殖必不可少。细胞无法自行合成足量的维生素，因此作为膳食补充剂，它们在组织培养中至关重要。

在细胞培养中，血清是维生素的主要来源；不过，为了使培养基适合特定类型的细胞，通常还会在其中添加各种维生素。最常见的是使用B族维生素来刺激细胞生长。

微量元素

铜、锌、硒以及三羧酸中间代谢物等化学元素被称为微量元素。为了替代血清中通常存在的微量元素，人们通常会在不含血清的培养基中添加微量元素。这些元素是健康细胞发育所必需的重要化学成分。 许多生化反应（如酶活性）都依赖于某些微量营养素。

培养基补充剂

针对某些细胞系建议使用的完整生长培养基，需要添加基础培养基和血清中缺乏的额外成分。这些营养补充剂有助于支持细胞生长和正常的代谢功能。

尽管激素、生长因子和信号分子对特定细胞系的正常增殖至关重要，但应始终采取以下预防措施：由于添加补充剂可能会改变完整培养基的渗透压，从而抑制细胞发育，因此建议在添加补充剂后始终核实渗透压。 对于大多数细胞系而言，最佳渗透压范围为260至320 mOSM/kg。

抗生素

抗生素常被用于抑制细菌和真菌污染物的生长[16]，尽管它们对细胞生长并非必需。由于抗生素可能会掩盖支原体和耐药细菌的污染，因此不建议在细胞培养中常规使用抗生素[17, 18]。

此外，抗生素可能会干扰高敏感细胞的新陈代谢。MilliporeSigma和Life Technologies生产的青霉素-链霉素组合制剂常被使用。 Plasmocin 已被用于 TS603、TS516 和 BT260 这三种胶质瘤细胞系的培养 [19]，且已被证明能有效清除支原体污染 (20)。

血清

血清中含有白蛋白、生长因子和生长抑制因子。血清是细胞培养基中最重要的成分之一，因为它能提供氨基酸、蛋白质、维生素（尤其是脂溶性维生素，如A、D、E和K）、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、矿物质和微量元素。

通常使用牛胎源和牛犊源血清来促进培养细胞的发育。胎源血清富含生长因子，适用于细胞克隆和敏感细胞的培养。由于其促进生长的能力较弱，牛犊血清常用于接触抑制实验。 常规培养基通常含有2%至10%的血清。向培养基中添加血清具有以下作用[21]：

• 血清为细胞提供必需营养物质（包括溶液中的营养物质和附着在蛋白质上的营养物质）。

• 血清中含有多种参与促进生长和特异性细胞活动的生长因子和激素。

• 血清提供多种结合蛋白，如白蛋白和转铁蛋白，这些蛋白质负责将其他化学物质运输到细胞内。例如，白蛋白将脂肪、维生素、激素等输送至细胞。

• 血清还提供纤维连接蛋白等蛋白质，这些蛋白质能增强细胞与基质的粘附力。此外，血清产生的铺展因子有助于细胞在分裂前进行铺展。

• 血清还提供蛋白酶抑制剂，以防止细胞内的蛋白质水解。

• 血清中还含有Na+、K+、Zn2+和Fe2+等矿物质。

• 它能提高培养基的粘度，从而在悬浮培养的搅拌过程中保护细胞免受机械损伤。

• 它还起缓冲作用。

参考文献

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