人类原代细胞

什么是人类原代细胞？

原代细胞是其所属组织最纯粹的代表。它们从组织中分离出来并经过处理，以便在理想条件的培养环境中建立细胞系。 由于它们源自组织而非经过基因修饰，因此更能模拟体内状态并表现出正常的生理功能。正因如此，它们可作为研究细胞药理学、毒理学和生理学（包括代谢、衰老及信号转导研究）的有用模型。 需要注意的是，与连续细胞系相比，原代细胞的培养和维持难度更大，因为它们的寿命较短，且在经历一定次数的细胞分裂后会停止分裂（或进入衰老状态）。 由于来自供体的原代细胞本身存在变异性，且受传代操作的影响，细胞信号传导通路的研究往往较为复杂。在开始信号传导研究之前，研究人员通常会进行筛选，以确定细胞是否对常用刺激作出反应。为避免浪费时间和资金，可在筛选前对原代细胞进行刺激，以激活主要信号传导通路。

为何使用人类原代细胞？

永生化细胞系通常被用作细胞检测模型。尽管科学家已认识到，细胞系引起的生物学变化可能对研究其生理意义产生不利影响。使用人类原代细胞可以提高通过细胞培养获得的数据的生理学价值，因此它们在研究生物过程、疾病进展和药物开发方面正日益被视为重要工具。

人原代细胞被广泛应用于细胞间和细胞内通信的体外研究、发育生物学，以及癌症、帕金森病和糖尿病等疾病的发病机制研究，此外还涉及许多其他临床前和探索性生物学研究领域。 长期以来，研究人员一直使用永生化细胞系来研究组织功能；然而，具有明显突变和染色体异常的细胞系可能无法很好地替代正常细胞，也无法准确反映疾病的早期发展过程。 如今，通过使用从特定组织中分离出来、并在原代细胞培养基和补充剂中维持的人原代细胞，可以建立更准确的特定组织细胞类型模型。

什么是原代细胞培养？

与使用永生化细胞系不同，原代细胞培养是指直接从体外多细胞生物体中培养细胞。在英国等一些国家，法律上已承认原代细胞培养比细胞系更能代表体内组织。 尽管如此，原代细胞需要合适的基质和营养物质才能生长，且在经历一定次数的分裂后，会呈现衰老表型，导致其永久停止分裂。这两个因素促使了细胞系的建立。 无论是自然永生化的原代细胞（如HeLa细胞），还是人工永生化的原代细胞（如HEK细胞），均可在细胞培养中无限期地培养。

按组织类型划分的人源原代细胞

上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、内皮细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及间充质干细胞等，是科学研究中最常用的原代细胞。 起初，这些培养物是异质的（代表了组织中存在的多种细胞类型的混合），且只能在体外存活特定时间。转化是一种体外过程，可对人类原代细胞进行操作，使其能够无限次传代。 转化可自然发生，也可由化学物质或病毒诱导。经过基因转化后，如果提供足够的营养和空间，原代培养物可以无限分裂，形成不朽化的继代细胞系。

内皮细胞

癌症治疗、伤口愈合、细胞信号传导研究、高通量和高内涵筛选以及毒理学筛选，这些领域都可从将原代内皮细胞用作研究工具中获益。

角质形成细胞

角质形成细胞源自成人皮肤表皮或新生儿包皮，在银屑病和癌症等皮肤疾病的研究中起着至关重要的作用。

上皮细胞

从癌症研究到毒理学调查，原代上皮细胞已被证明是模拟人体自然防御机制的宝贵资源。

成纤维细胞

诱导多能干细胞（iPS细胞）和研究伤口愈合，只是原代成纤维细胞众多用途中的一小部分。

免疫细胞

外周血单核细胞（简称 PBMC）是血液中具有圆形细胞核的单核细胞。它们主要包括淋巴细胞和单核细胞，这些细胞在免疫应答过程中发挥着重要作用。 外周血单核细胞常用于诊断感染或检测疫苗可能提供的保护作用。深入了解由T细胞介导的细胞免疫反应往往至关重要。

黑色素细胞

黑色素细胞是产生黑色素的专门皮肤细胞，可作为研究模型，用于探索伤口愈合、毒性、黑色素瘤、皮肤对紫外线（UV）辐射的反应、皮肤疾病以及化妆品等课题。

干细胞

干细胞具有分化为多种细胞类型的潜力。凭借其分化能力，它们为构建人体组织模型和模拟健康状况提供了新的机遇。

间充质干细胞

间充质干细胞（也称为MSCs）可从骨髓、脂肪（脂肪组织）、脐带组织（华通氏胶）和羊水（包围胎儿的液体）等不同人体来源中获取，并可在体外扩增。 这些成体基质干细胞具有分化为多种细胞类型的能力，其中包括骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、皮肤细胞和角膜细胞等。

平滑肌细胞

在中空器官内，原代平滑肌细胞（SMCs）覆盖内壁并介导收缩功能。除癌症和其他疾病外，平滑肌细胞还可用于建立高血压纤维化的模型。

原代细胞与细胞系

无论是通过自发突变（如转化后的癌细胞系），还是通过人为改变（如人工合成癌基因），连续细胞系都获得了无限增殖的潜力（永生化）。通常情况下，与原代细胞相比，连续细胞系更可靠且更便于操作。 它们可以无限扩增，并能快速获取关键数据。连续细胞系的使用存在某些局限性，包括它们经过基因改造/转化，这可能会改变其生理特征，使其与体内状况不符；此外，随着传代次数的增加，这些特征还会随时间进一步发生变化。

原代细胞培养的进展

原代细胞素来以操作困难而闻名。然而，得益于原代细胞培养技术的进步、配备完全优化操作方案的商业化原代细胞的普及，以及对操作要求更低的新型分析技术，其操作过程正变得比以往任何时候都更加简便。

从二维细胞培养向三维细胞培养的转变被视为该领域的一个重要里程碑。在二维培养中，组织特异性结构、细胞间相互作用以及力学/生化信号传导可能会受到削弱。因此，此类培养的生物学价值存在上限。

另一方面，三维细胞培养使细胞能够在三维细胞外支架中增殖并与之相互作用。这使得细胞能够相互作用并作用于细胞外基质，从而使三维培养更具生理相关性。 该方法在预测体内反应方面的准确性，使其在药物发现与开发等领域产生了革命性影响。正因如此，源自患者的类器官和芯片上的器官等尖端技术，为药物筛选与开发提供了高度情境化的模型。

原代细胞的制备是原代培养中的一个瓶颈。 通常需要更大的组织样本量来克服这一瓶颈，但这往往难以实现。然而，分析灵敏度的提高正为突破这一瓶颈指明方向。例如，通过应用单细胞技术（包括测序、Western blot和质谱流式细胞术），可以减少对大量原代细胞培养的需求。

原代细胞培养的前景广阔

随着技术的进步，原代细胞培养面临的整体困难正在逐渐缓解。反过来，这种方法正迅速取代其他方法，成为细胞和分子生物学研究与实践中的金标准。疫苗生产、器官移植、干细胞疗法、癌症研究等众多领域都将从原代细胞培养的持续进步中获益匪浅。

原代细胞培养的技巧与诀窍

细胞扩增的需求

培养原代细胞最常见的两种方法是悬浮培养和表面（2D）培养。有些细胞能够自由漂浮在血液中，而不会附着在任何表面上（例如源自外周血的细胞）。 目前已通过工程改造，使某些细胞系能在悬浮培养中茁壮生长，其细胞密度可达二维培养条件下无法企及的水平。需要在体外附着于基质才能生长的原代细胞被称为贴壁细胞，其中包括来自实体组织的细胞。 为了改善粘附特性并提供生长和分化所需的其他信号，这些细胞通常在平底未涂层塑料培养皿中培养，但有时也会使用微载体。后者可能涂覆有细胞外基质蛋白（如胶原蛋白和层粘连蛋白）。 细胞培养中使用的培养基由基础培养基组成，其中添加了适当的生长因子和细胞因子。细胞培养箱是一种特殊的实验室培养箱，用于在特定温度和气体混合物条件下（哺乳动物细胞通常为37 °C、5% CO₂）培养和维持细胞。 根据所培养细胞的类型不同，最佳培养条件可能存在显著差异。根据所培养细胞的类型，最佳生长培养基将包含独特的因子组合，包括但不限于pH值、葡萄糖浓度、生长因子以及其他营养物质的存在。

在原代培养建立阶段，培养基中的抗生素对于防止宿主组织污染至关重要。 某些抗生素方案会结合使用庆大霉素、青霉素、链霉素和两性霉素 B。但不建议长期使用抗生素，因为某些试剂（如两性霉素 B）长期使用可能会对细胞产生毒性。

大多数原代细胞在经历一定次数的细胞倍增后会进入衰老并停止分裂，因此，在分离后保持其存活至关重要。 要确保细胞长期存活，需要掌握专业的细胞培养技术并提供理想的培养条件（包括合适的培养基、温度、气体混合物、pH 值、生长因子浓度、营养物质和葡萄糖）。 由于用于补充培养基的许多生长因子是从动物血液中提取的（源自血液的成分存在污染风险），因此建议尽量减少或完全避免使用这些生长因子。采用无菌操作技术也很重要。

传代与维持

当分离出的细胞附着在培养皿表面时，即标志着维持阶段的开始。细胞通常在培养开始后24小时发生附着。 当细胞达到一定的汇合率且处于活跃增殖状态时，应进行传代。由于汇合后的细胞可能发生分化，且传代后增殖速度会减慢，因此最好在原代细胞培养达到100%汇合率之前进行传代。

在新鲜培养基中传代可维持锚定依赖性细胞的指数增长。单层细胞的传代会破坏细胞间及细胞内的细胞表面相互作用。 使用低浓度的蛋白水解酶（如胰蛋白酶/EDTA）可将贴壁原代细胞从单层或组织中提取出来。细胞经解离并稀释成单细胞悬液后，进行计数并转移至新的培养容器中，以便重新附着并增殖。

冷冻保存与复苏

冷冻保存是通过在低温下冷冻细胞来保存活细胞。对人类原代细胞进行冷冻保存和解冻，可防止细胞在储存和使用过程中死亡和受损。人类原代细胞使用二甲基亚砜（DMSO）或甘油进行冷冻保护（需在正确温度下并控制冷冻速率）。 冷冻过程必须循序渐进，每分钟降温1°C，以防止冰晶形成。长期储存需要液氮（-196 °C）或低于-130 °C的温度。

将冷冻细胞浸入37 °C的水浴中约1至2分钟，即可完成冷冻保存细胞的解冻。人原代细胞从冷冻箱中取出解冻后不应进行离心（因为它们在从冷冻保存中恢复期间对损伤极为敏感）。 该方法适用于解冻后立即传代，并能促进细胞在传代后最初24小时内的贴壁。1 冷冻保存的原代细胞贴壁后，必须清除旧培养基（因为二甲基亚砜（DMSO）对原代细胞有害，可能会导致解冻后存活率下降）。