发布日期：2023年 | 最后修订日期：2026年5月
细胞冷冻综合指南：确保细胞活力和无菌性
细胞冷冻是细胞培养管理中的关键环节，可确保珍贵细胞系的长期储存与保存。无论处理人类细胞还是动物细胞，遵循精确的操作规程并保持严格的无菌操作技术，对于成功实现冷冻保存至关重要。
本指南详细介绍了所需材料、试剂及分步操作流程，旨在帮助研究人员在有效冷冻细胞的同时，保持其活力和无菌性。遵循这些指南，研究人员可以放心地储存细胞培养物，并在后续复苏时最大限度地减少细胞活力损失，从而确保实验结果的完整性和可靠性。
首先，必须建立无菌操作环境。正确的无菌操作技术在防止污染和确保培养物无菌性方面起着至关重要的作用。
无菌操作技术
在整个过程中遵循无菌操作技术，以确保细胞培养物的无菌性。
全面的细胞冷冻流程
本流程图详细展示了细胞正确冷冻过程中必备步骤的视觉指南。遵循这些步骤，可确保细胞在冷冻保存过程中保持高存活率和完整性。
冷冻培养基的制备
根据细胞类型配制冷保护冷冻培养基：
- 含胎牛血清（FBS）的培养基：90% FBS + 10% 二甲基亚砜（DMSO），或 70% 生长培养基、20% FBS 及 10% DMSO
- 需添加甘油的细胞：90% FBS + 10% 甘油
建议选用我司预配制冷冻培养基：
- 冷冻培养基 CM-1：适用于需要含胎牛血清（FBS）培养基的实验方案
- 冷冻培养基 CM-ACF - 无血清型：适用于需要无 FBS 替代方案的情况
细胞制备
对于贴壁细胞：
- 观察细胞直至其汇合度达到85–95%
- 吸出旧培养基
- 用不含钙和镁的PBS冲洗细胞单层
- 使用Accutase、胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞脱落，必要时用培养基中和
- 将细胞悬液转移至50 mL Falcon管中
对于悬浮细胞：
- 在显微镜下检查细胞密度和健康状况
- 将细胞悬液直接转移至50 mL Falcon离心管中
细胞计数与离心
- 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行计数
- 在室温下以300g离心3-5分钟，使细胞沉淀
- 小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀
- 使用前将制备好的冷冻培养基加热至37°C
冷冻保存
- 将细胞沉淀用冷冻培养基重悬，贴壁细胞浓度为200万个细胞/毫升，悬浮细胞浓度为500万个细胞/毫升，或按所需浓度调整
- 将 1.0 毫升（或根据需要更多）细胞悬液分装到贴有标签的冷冻管中
- 在将细胞转移至长期储存前，请采用慢冻法
- ？方法
- ? 步骤
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手动冷冻 -
1️⃣ 将细胞置于冷冻培养基中，放入4°C冷冻箱冷冻40分钟。
2️⃣ 转移至-80°C冷冻箱冷冻24小时。
3️⃣ 将细胞保存在液氮中进行长期保存。 -
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使用 Mr. Frosty -
1️⃣ 将细胞与冷冻培养基一同装入冷冻管中。
2️⃣ 将冷冻管放入Mr. Frosty容器内。
3️⃣ 在-80°C下保存24小时后，再转移至液氮中。 -
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控速冷冻机 -
1️⃣ 设置设备以渐进式降温。
2️⃣ 将制备好的细胞放入冷冻箱。
3️⃣ 冷冻周期结束后，将细胞转移至液氮中。
- 为长期保存，请将冷冻管储存在-130°C以下的温度环境中或置于液氮中。
材料与试剂
- 1–2 mL 冷冻管
- CoolCell® 冷冻装置或控速冷冻箱
- 冷冻保护剂（例如：自制冷冻保护剂、CM-1、CM-ACF 或专用培养基）
- 胎牛血清（FBS）或培养上清液
- 二甲基亚砜（DMSO）或甘油
- 无钙无镁PBS
- Accutase、胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA（用于贴壁细胞）
- 15 毫升或 50 毫升 Falcon 管
- 血细胞计数板或自动细胞计数仪
- 离心机