发布日期：2023年 | 最后审阅日期：2026年5月

细胞培养解离技术

细胞培养去附着是细胞培养维护中的关键步骤。该过程涉及将细胞从生长基底上剥离，以便进行传代或收获。本节概述了两种主要方法：使用无酶去附着缓冲液和使用酶制剂。

使用无酶细胞分离缓冲液

该方法操作温和，无需使用酶即可保持细胞完整性：

1. 制备
   • 使用前请确保所有试剂均已预热至37°C，以避免对细胞造成热冲击。
2. 去除培养基：
   • 将培养容器中的旧培养基弃去。
3. 冲洗
   • 每只T75培养瓶或100 mm培养皿用5 ml不含钙镁的PBS冲洗细胞单层。
   • 在室温下轻轻摇动培养容器 30 至 60 秒。
   • 吸出并弃去冲洗液。
   • 重复此冲洗步骤一次。
4. 细胞分离
   • 向容器中加入约 5 毫升不含酶的细胞分离缓冲液。
   • 在室温下轻轻摇动 1 至 2 分钟，并在显微镜下检查细胞是否已解离。
   • 如有必要，用手轻敲烧瓶或培养皿，使细胞脱落。
   • 如果细胞仍附着，请将其在室温下静置 2 至 5 分钟，如有必要，再次轻敲，并添加更多的分离缓冲液。
   • 一旦细胞脱离，加入至少 5 毫升完全培养基以中和分离缓冲液，并使细胞重新悬浮。
5. 活力检查
   • 在传代过程中监测细胞活力，确保其保持在 90% 以上。

使用其他试剂进行分离

此方法允许使用各种解离试剂：

1. 弃去用过的培养基
   • 将培养容器中的旧培养基弃去。
2. 细胞洗涤
   • 使用不含钙和镁的平衡盐溶液或EDTA对细胞进行洗涤。
   • 将洗涤液轻轻加入与细胞相对的一侧，摇动培养容器1至2分钟，然后弃去洗涤液。
3. 细胞分离
   • 每 25 平方厘米的生长表面加入 2 至 3 毫升选定的分离溶液，确保覆盖细胞片。
   • 将培养皿在 37°C 下培养，并轻轻摇动。根据细胞系的不同，解离通常在 5 到 15 分钟内发生。
   • 对于顽固的细胞，轻敲培养皿可以加快该过程。
   • 仔细观察细胞，以防止过度暴露和潜在损伤。
4. 收获细胞
   • 一旦细胞完全脱离，将容器直立，让细胞沉积在容器底部。
   • 加入完全培养基，然后用移液管在细胞层上方吸取，使细胞分散并收集起来。
   • 计数并进行传代。

在两种方法中，通过经验观察确定每条细胞系的最佳条件都很重要。该过程应保持细胞活力，并在传代过程中定期检查，确保细胞活力超过 90%。这些程序为研究人员根据其细胞线的具体要求和特性进行调整提供了基础。

贴壁细胞传代技术概述

要有效传代贴壁细胞，必须先将其从培养容器中剥离。目前采用多种方法，每种方法适用于不同的细胞类型和条件。在选择分离方法时，必须充分考虑细胞系的具体需求和实验目标。 定期监测细胞存活率（目标是在传代时保持高于90%）对于维持培养物的健康和生产力至关重要。以下是这些操作流程的概述：