תאי HaCaT-ras II-4

1. השלכת המדיום הישן: הסר את המדיום הישן מהבקבוקים.
2. שטוף את התאים: הוסף 3-5 מ"ל PBS (ללא סידן ומגנזיום) לבקבוקי T25, או 5-10 מ"ל לבקבוקי T75, כדי לשטוף את התאים הדבוקים.
3. הוסף תמיסת EDTA: כסה את שכבת התאים לחלוטין בתמיסת EDTA 0.05% שהוכנה זה עתה - השתמש ב-1-2 מ"ל לבקבוקי T25 ו-2.5 מ"ל לבקבוקי T75.
4. דגירה: דגרו את הבקבוקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
5. הוסף תמיסת טריפסין/EDTA: לאחר הדגירה, הוסף תמיסת טריפסין/EDTA טרייה (0.05% טריפסין, 0.025% EDTA) לבקבוקים, תוך הקפדה על כיסוי מלא של התאים - השתמש ב-1 מ"ל לבקבוקי T25 ו-2.5 מ"ל לבקבוקי T75.
6. עקוב אחר ההתנתקות: התבונן בתאים, אשר אמורים להתנתק תוך 1-2 דקות.
7. נטרול הטריפסין: הוסף תמיסת תרבית תאים המכילה FBS כדי לעצור את פעילות הטריפסין.
8. העברת תאים: מזגו את תמיסת התאים לתוך בקבוקים חדשים שמולאו מראש במדיום תרבית טרי.

1. ודא שהבקבוקון נשאר קפוא לחלוטין בעת המסירה, שכן התאים נשלחים בקרח יבש כדי לשמור על טמפרטורה אופטימלית במהלך ההובלה.

2. עם קבלת המשלוח, אחסן את הבקבוקון הקריוגני מיד בטמפרטורה נמוכה מ-150°C כדי להבטיח את שמירת שלמות התאים, או המשך לשלב 3 אם נדרשת תרבית מיידית.

3. לצורך תרבית מיידית, הפשיר את הבקבוקון במהירות על ידי טבילתו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם מים נקיים וחומר אנטי-מיקרוביאלי, תוך ערבוב עדין במשך 40-60 שניות עד שנותר גוש קרח קטן.

4. בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים במנדף, וחטא את בקבוקון הקריוואלי באתנול 70% לפני הפתיחה.

5. פתח בזהירות את הבקבוקון המחוטא והעבר את תמיסת התאים לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של מצע תרבית בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב עדין.

6. סובבו את התערובת בצנטריפוגה ב-300 x g למשך 3 דקות כדי להפריד את התאים, וזרקו בזהירות את הנוזל העליון המכיל את שאריות מצע ההקפאה.

7. השרו בעדינות את משקע התאים ב-10 מ"ל של מצע תרבית טרי. עבור תאים נצמדים, חלקו את התמיסה בין שני צלוחיות תרבית T25; עבור תרבויות תמיסה, העבירו את כל המצע לצלוחית T25 אחת כדי לקדם אינטראקציה וצמיחה יעילות של התאים.

8. הקפידו על פרוטוקולי תת-תרבות קבועים להמשך צמיחה ותחזוקה של קו התאים, כדי להבטיח תוצאות ניסוי אמינות.

37°C, 5%_CO2, אווירה לחה.

שורות תאים שהוקפאו נשלחות בקרח יבש באריזה מאושרת ומבודדת עם כמות מספקת של חומר קירור כדי לשמור על טמפרטורה של כ-78°C- במהלך ההובלה. עם קבלת המשלוח, יש לבדוק את המכל מיד ולהעביר את הבקבוקונים ללא דיחוי לאחסון מתאים.

שורות תאים שהוקפאו נשלחות בקרח יבש באריזה מאושרת ומבודדת עם כמות מספקת של חומר קירור כדי לשמור על טמפרטורה של כ-78°C- במהלך ההובלה. עם קבלת המשלוח, יש לבדוק את המכל מיד ולהעביר את הבקבוקונים ללא דיחוי לאחסון מתאים.

לשימור לטווח ארוך, יש להניח את הבקבוקונים בחנקן נוזלי במצב של אדי בטמפרטורה של כ-150 עד 196 מעלות צלזיוס. אחסון בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס מקובל רק כצעד ביניים קצר לפני העברה לחנקן נוזלי.

זיהום במיקופלסמה נשלל באמצעות בדיקות מבוססות PCR ושיטות זיהוי מיקופלסמה מבוססות לומניסצנציה.

כדי להבטיח שאין זיהום חיידקי, פטרייתי או שמרי, תרבויות התאים עוברות בדיקות ויזואליות יומיות.