| Milieu de culture |
RPMI 1640, contenant 2,0 mM de glutamine stable et 2,0 g/L de NaHCO₃ (numéro d'article Cytion 820700a) |
| Suppléments |
Compléter le milieu avec 10 % de FBS, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM d’HEPES et 1 % de NEAA. Ajouter de la Geneticin (G418-Sulfat) pour obtenir une concentration finale de 1 mg/mL. |
| Réactif de dissociation |
Trypsine-EDTA |
| Temps de doublement |
environ 24 à 36 heures |
| Repiquage |
Pour une culture cellulaire adhérente de routine : Aspirer l’ancien milieu de culture des cellules adhérentes, puis les laver avec du PBS afin d’éliminer tout résidu de milieu. Après avoir aspiré le PBS, ajouter le volume approprié de solution de trypsine/EDTA en fonction de la taille du récipient de culture (p. ex., 1 ml pour un flacon T25, 3 ml pour un flacon T75), puis incubez à température ambiante ou à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent (5 à 10 minutes). Surveillez le détachement au microscope et tapotez doucement le récipient si nécessaire pour libérer les cellules. Une fois les cellules détachées, ajoutez du milieu complet pour inactiver la trypsine/EDTA, remettez délicatement les cellules en suspension, puis transférez une aliquote de la suspension cellulaire dans un nouveau récipient de culture contenant du milieu frais. Placer le récipient dans un incubateur réglé à 37 °C avec 5 % de CO₂, et changer le milieu tous les 2 à 3 jours. |
| Rapport de fractionnement |
1 à 5 |
| Densité de semis |
de 2 à 4 × 10⁴ cellules/cm² |
| Renouvellement des fluides |
2 à 3 fois par semaine |
| Rétablissement après le dégel |
Après la décongélation, répartissez les cellules dans des flacons T25 selon un rapport de 1:2 à 1:3 et laissez-les se remettre du processus de congélation et adhérer pendant au moins 24 heures. Pour optimiser l’adhérence et la viabilité des cellules après la décongélation, nous recommandons d’utiliser des flacons ou des plaques enduits de collagène pour l’ensemencement initial après la cryorécupération. L’enduction de collagène n’est pas nécessaire pour la culture de routine ultérieure des cellules. |
| Milieu de congélation |
Comme milieu de cryoconservation, nous utilisons un milieu de croissance complet (contenant du sérum fœtal bovin) + 10 % de DMSO pour assurer une viabilité adéquate après décongélation, ou du CM-1 (référence Cytion 800100), qui contient des osmoprotecteurs et des stabilisateurs métaboliques optimisés pour améliorer la récupération et réduire le stress induit par la cryoconservation. |
| Décongélation et culture des cellules |
Assurez-vous que le flacon reste bien congelé à la livraison, car les cellules sont expédiées sur de la glace sèche afin de maintenir des températures optimales pendant le transport.
À la réception, conservez immédiatement le cryofiole à une température inférieure à -150 °C pour garantir la préservation de l’intégrité cellulaire, ou passez à l’étape 3 si une culture immédiate est nécessaire.
Pour une culture immédiate, décongelez rapidement le flacon en l’immergeant dans un bain-marie à 37 °C contenant de l’eau propre et un agent antimicrobien, en agitant doucement pendant 40 à 60 secondes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace.
Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire, en désinfectant le cryotube avec de l’éthanol à 70 % avant de l’ouvrir.
Ouvrez avec précaution le flacon désinfecté et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture à température ambiante, en mélangeant délicatement.
Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les cellules, puis jeter avec précaution le surnageant contenant le milieu de congélation résiduel.
Remettre délicatement le culot cellulaire en suspension dans 10 ml de milieu de culture frais. Pour les cellules adhérentes, répartir la suspension dans deux flacons de culture T25; pour les cultures en suspension, transférer la totalité du milieu dans un seul flacon T25 afin de favoriser une interaction et une croissance cellulaires efficaces.
Respectez les protocoles de sous-culture établis pour assurer la croissance continue et le maintien de la lignée cellulaire, garantissant ainsi des résultats expérimentaux fiables.
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| Atmosphère d'incubation |
37 °C, 5 % de CO₂, atmosphère humidifiée. |
| Conditions d'expédition |
Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié. |
| Conditions d'entreposage |
Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide. |
