Células primarias humanas

¿Qué son las células primarias humanas?

Las células primarias son la representación más pura de sus respectivos tejidos. Se aíslan del tejido y se procesan para que puedan establecerse en un entorno de cultivo con condiciones ideales. Imitan más fielmente el estado in vivo y muestran una fisiología normal, ya que se derivan del tejido en lugar de ser modificadas. Por ello, pueden servir como modelos útiles para la investigación en farmacología celular, toxicología y fisiología (incluidos estudios sobre el metabolismo, el envejecimiento y la transducción de señales). Hay que tener en cuenta que las células primarias son más difíciles de cultivar y mantener que una línea celular continua, ya que tienen una vida útil más corta y dejan de dividirse (o envejecen) después de un cierto número de divisiones celulares. Los estudios de las vías de señalización celular se complican debido a la variabilidad inherente de las células primarias obtenidas de donantes y a través de las prácticas de subcultivo. Antes de comenzar los estudios de señalización, los investigadores suelen realizar un cribado para determinar si las células responden o no a los estímulos de uso común. Para evitar perder tiempo y dinero, las células primarias pueden ser estimuladas para activar las principales vías de señalización antes de ser sometidas al cribado.

¿Por qué usar células primarias humanas?

Las líneas celulares inmortalizadas se utilizan comúnmente como ensayo celular. Sin embargo, los científicos han reconocido que los cambios biológicos debidos a las líneas celulares pueden ser perjudiciales al estudiar su importancia fisiológica. El uso de células primarias humanas mejora el valor fisiológico de los datos obtenidos a través de cultivos celulares, y cada vez se las considera más importantes para estudiar procesos biológicos, la progresión de enfermedades y el desarrollo de medicamentos.

Las células primarias humanas se utilizan ampliamente en estudios in vitro de la comunicación intercelular e intracelular, la biología del desarrollo y los mecanismos subyacentes al cáncer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes, entre muchas otras áreas de investigación biológica preclínica y de investigación. Los investigadores han utilizado durante mucho tiempo líneas celulares inmortalizadas para estudiar la función de los tejidos; sin embargo, las líneas celulares con mutaciones evidentes y anomalías cromosómicas pueden no ser buenos sustitutos de las células normales ni del desarrollo de la enfermedad en sus etapas tempranas. Ahora es posible lograr un modelo más preciso de un tipo celular específico de un tejido mediante el uso de células primarias humanas aisladas de ese tejido y mantenidas en medios de cultivo de células primarias y suplementos.

¿Qué es el cultivo de células primarias?

En lugar de utilizar líneas celulares inmortalizadas, el cultivo de células primarias consiste en cultivar células directamente a partir de un organismo multicelular fuera del cuerpo. En algunos países, como el Reino Unido, existe reconocimiento legal de que los cultivos de células primarias son más representativos de los tejidos in vivo que las líneas celulares. No obstante, las células primarias necesitan el sustrato y los nutrientes adecuados para crecer, y después de un cierto número de divisiones, desarrollan un fenotipo senescente que hace que dejen de dividirse de manera permanente. Estos dos factores motivan la creación de líneas celulares. Tanto las células primarias inmortalizadas naturalmente (p. ej., las células HeLa) como las inmortalizadas artificialmente (p. ej., las células HEK) pueden cultivarse indefinidamente en cultivo celular.

Células primarias humanas por tipos de tejido

Las células epiteliales, los fibroblastos, los queratinocitos, los melanocitos, las células endoteliales, las células musculares, las células inmunitarias y las células madre, como las células madre mesenquimales, se encuentran entre las células primarias humanas más utilizadas en los estudios científicos. Para empezar, los cultivos son heterogéneos (representan una mezcla de los tipos de células presentes en el tejido) y solo pueden mantenerse vivos in vitro durante un tiempo específico. La transformación es un proceso in vitro que permite manipular las células primarias humanas para obtener subcultivos ilimitados. La transformación puede ocurrir de forma natural o puede ser inducida por sustancias químicas o virus. Tras sufrir una transformación genética, un cultivo primario puede dividirse indefinidamente hasta convertirse en una línea celular secundaria inmortalizada si se le proporcionan suficientes nutrientes y espacio.

Células endoteliales

El tratamiento del cáncer, la cicatrización de heridas, la investigación sobre la señalización celular, el cribado de alto rendimiento y alto contenido, y el cribado toxicológico son solo algunas de las áreas que pueden beneficiarse del uso de células endoteliales primarias como herramienta de investigación.

Queratinocitos

Los queratinocitos, derivados de la epidermis de la piel humana adulta o del prepucio neonatal, desempeñan un papel crucial en el estudio de enfermedades de la piel como la psoriasis y el cáncer.

Células epiteliales

Desde estudios sobre el cáncer hasta investigaciones toxicológicas, las células epiteliales primarias han demostrado ser recursos invaluables para modelar las defensas naturales del cuerpo.

Fibroblastos

La inducción de células madre pluripotentes (iPS) y el estudio de la cicatrización de heridas son solo algunos de los muchos usos de los fibroblastos primarios.

Células inmunitarias

Las células mononucleares de sangre periférica, o PBMC por sus siglas en inglés, son células mononucleares de la sangre con un núcleo redondo. Incluyen principalmente linfocitos y monocitos, que desempeñan funciones importantes en el curso de una respuesta inmunitaria. Las células mononucleares de sangre periférica se utilizan a menudo para diagnosticar infecciones o para detectar una posible protección vacunal. Comprender la respuesta inmunitaria celular mediada por las células T suele ser crucial.

Melanocitos

Los melanocitos, las células cutáneas especializadas que producen el pigmento melanina, son útiles como modelos para la investigación en temas como la cicatrización de heridas, la toxicidad, el melanoma, la respuesta dérmica a la radiación ultravioleta (UV), las enfermedades de la piel y los cosméticos.

Células madre

Las células madre tienen el potencial de diferenciarse en una amplia variedad de tipos celulares. Debido a su capacidad de diferenciación, ofrecen nuevas oportunidades para modelar tejidos humanos y afecciones de salud.

Células madre mesenquimales

Las células madre mesenquimales, también conocidas como MSC, pueden obtenerse de diferentes fuentes humanas, como la médula ósea, la grasa (tejido adiposo), el tejido del cordón umbilical (gelatina de Wharton) y el líquido amniótico (el líquido que rodea al feto), y pueden multiplicarse in vitro. Estas células madre estromales adultas tienen la capacidad de convertirse en una amplia variedad de tipos celulares. Algunos de estos tipos celulares incluyen células óseas, células cartilaginosas, células musculares, células neuronales, células cutáneas y células corneales.

Células del músculo liso

Dentro de los órganos huecos, las células primarias del músculo liso (SMC) recubren el interior y median la contractilidad. Además de para el cáncer y otras enfermedades, las SMC pueden utilizarse para modelar la fibrosis asociada a la hipertensión.

Células primarias y líneas celulares

Ya sea por mutación espontánea, como en las líneas celulares cancerosas transformadas, o mediante alteración intencional, como en la producción artificial de genes cancerosos, las líneas celulares continuas han adquirido la capacidad de reproducirse indefinidamente (inmortalizadas). Por regla general, las líneas celulares continuas son más confiables y fáciles de manejar que las células primarias. Pueden expandirse indefinidamente y brindan acceso rápido a datos esenciales. El uso de líneas celulares continuas tiene ciertas limitaciones, entre ellas el hecho de que están genéticamente modificadas o transformadas, lo que podría alterar sus características fisiológicas y hacer que no se correspondan con las condiciones in vivo, y que esto puede cambiar aún más con el tiempo debido a un número significativo de pases.

Avances en el cultivo de células primarias

Las células primarias tienen una notoria reputación de ser difíciles de manejar. Sin embargo, el proceso se está volviendo más sencillo que nunca gracias a los avances en el cultivo de células primarias, la disponibilidad de células primarias comerciales con protocolos totalmente optimizados y nuevas técnicas de análisis que requieren menos esfuerzo.

El cambio del cultivo celular bidimensional al tridimensional se considera un hito importante en el campo. La arquitectura específica del tejido, las interacciones célula-célula y la señalización mecánica y bioquímica pueden verse atenuadas en un cultivo 2D. Por lo tanto, el valor biológico de estos cultivos tiene un límite.

Por otro lado, el cultivo celular tridimensional permite que las células se expandan e interactúen con un andamio extracelular tridimensional. Esto permite que las células interactúen entre sí y con la matriz extracelular, lo que hace que los cultivos tridimensionales sean más relevantes desde el punto de vista fisiológico. La precisión de este método para predecir respuestas in vivo lo ha convertido en algo revolucionario en campos como el descubrimiento y el desarrollo de fármacos. Por ello, tecnologías de vanguardia, como los organoides derivados de pacientes y los «órganos en un chip», proporcionan modelos altamente contextuales para la selección y el desarrollo de fármacos.

La generación de células primarias es un cuello de botella en el cultivo primario. Por lo general, se requiere un mayor volumen de tejido para superar esto, lo cual puede ser difícil de lograr. Sin embargo, la mayor sensibilidad analítica está abriendo un nuevo camino. Por ejemplo, la necesidad de cultivar grandes cantidades de células primarias se reduce mediante el uso de tecnología de célula única, que incluye secuenciación, western blot y citometría de masas.

Perspectivas prometedoras para el cultivo de células primarias

Las dificultades generales del cultivo de células primarias se están mitigando gracias a los avances tecnológicos. A su vez, este método está reemplazando rápidamente a otros como el estándar de referencia en el estudio y la práctica de la biología celular y molecular. La fabricación de vacunas, el reemplazo de órganos, las terapias con células madre, la investigación del cáncer y mucho más se beneficiarán enormemente de los continuos avances en el cultivo de células primarias.

Consejos y trucos para el cultivo de células primarias

Las necesidades de la expansión celular

Los dos métodos más comunes para cultivar células primarias son en suspensión o sobre una superficie (2D). Algunas células pueden flotar libremente en el torrente sanguíneo sin adherirse nunca a una superficie (por ejemplo, las derivadas de la sangre periférica). Se han diseñado diferentes líneas celulares para que prosperen en cultivos en suspensión, donde pueden alcanzar densidades inalcanzables en condiciones de crecimiento 2D. Las células primarias que necesitan anclaje para crecer in vitro se denominan células adherentes e incluyen aquellas que se encuentran en los tejidos sólidos. Para mejorar las propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación, estas células suelen cultivarse en un recipiente plano de plástico sin recubrimiento, aunque en ocasiones se utiliza un microportador. Esta última opción puede recubrirse con proteínas de la matriz extracelular (como el colágeno y la laminina). Los medios utilizados en el cultivo celular consisten en un medio básico al que se le han agregado los factores de crecimiento y las citocinas adecuados. Una incubadora celular es un tipo especial de incubadora de laboratorio que se utiliza para cultivar y mantener las células a una temperatura y una mezcla de gases específicas (por lo general, 37 °C y 5 % de CO₂ para las células de mamíferos). Dependiendo del tipo de célula que se cultive, las condiciones óptimas pueden variar considerablemente. Según los tipos de células que se cultiven, el medio de crecimiento óptimo tendrá una combinación única de factores, que incluyen, entre otros, el pH, la concentración de glucosa, los factores de crecimiento y la presencia de otros nutrientes.

Los antibióticos en el medio de crecimiento son cruciales durante el establecimiento del cultivo primario para prevenir la contaminación proveniente del tejido del huésped. Algunos regímenes antibióticos incluyen una combinación de gentamicina, penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Sin embargo, no se recomienda el uso de antibióticos durante un período prolongado, ya que algunos reactivos (como la anfotericina B) pueden resultar tóxicos para las células a largo plazo.

La mayoría de las células primarias pasan por la senescencia y dejan de dividirse después de un cierto número de duplicaciones poblacionales, por lo que es crucial mantenerlas vivas después del aislamiento. La viabilidad celular a largo plazo requiere técnicas expertas de cultivo celular y condiciones de cultivo ideales (incluidos el medio adecuado, la temperatura adecuada, la mezcla de gases adecuada, el pH adecuado, la concentración adecuada de factores de crecimiento, la presencia de nutrientes y la presencia de glucosa). Dado que muchos de los factores de crecimiento utilizados para complementar los medios se obtienen de la sangre animal (los ingredientes derivados de la sangre presentan un riesgo de contaminación), se recomienda minimizar su uso o evitarlo por completo. También es importante utilizar una técnica aséptica.

Subcultivo y mantenimiento

Cuando las células aisladas se adhieren a la superficie de la placa de cultivo, esto marca el inicio de la fase de mantenimiento. La adhesión suele ocurrir 24 horas después del inicio del cultivo. Las células deben someterse a subcultivo cuando hayan alcanzado un cierto porcentaje de confluencia y se estén replicando activamente. Dado que las células posconfluentes pueden sufrir diferenciación y presentar una proliferación más lenta tras el paso, es mejor realizar el subcultivo de los cultivos de células primarias antes de que alcancen el 100 % de confluencia.

El subcultivo en medios frescos mantiene el crecimiento exponencial de las células dependientes de anclaje. El subcultivo de monocapas interrumpe las interacciones intercelulares e intracelulares en la superficie celular. Se emplean bajas concentraciones de enzimas proteolíticas, como la tripsina/EDTA, para extraer células primarias adherentes de monocapas o tejidos. Después de disociarlas y diluirlas en una solución de células individuales, las células se cuentan y se transfieren a recipientes de cultivo nuevos para que se vuelvan a adherir y se multipliquen.

Criopreservación y recuperación

La criopreservación conserva las células vivas mediante su congelación a bajas temperaturas. La criopreservación y la descongelación de células primarias humanas evitan la muerte celular y el daño durante el almacenamiento y el uso. Las células primarias humanas se crioprotegen con DMSO o glicerol (a la temperatura adecuada y con una velocidad de congelación controlada). El proceso de congelación debe ser progresivo, a -1 °C por minuto, para evitar la formación de cristales de hielo. El almacenamiento a largo plazo requiere nitrógeno líquido (-196 °C) o temperaturas inferiores a -130 °C.

Para descongelar las células criopreservadas, basta con sumergir las células congeladas en un baño de agua a 37 °C durante aproximadamente 1 a 2 minutos. Las células primarias humanas no deben centrifugarse después de sacarlas del congelador (ya que son extremadamente sensibles al daño durante la recuperación de la criopreservación). Es adecuado para sembrar las células inmediatamente después de la descongelación y favorece la adhesión en los cultivos durante las primeras 24 horas posteriores a la siembra. 1 Una vez que las células primarias criopreservadas se hayan adherido, se debe retirar el medio usado (ya que el DMSO es dañino para las células primarias y puede provocar una disminución de la viabilidad tras la descongelación).