Medios de cultivo celular: una visión general

En el campo de las ciencias de la vida, una de las metodologías más importantes es el cultivo celular. El término «cultivo celular» se refiere a la extracción de células, tejidos u órganos de un animal o una planta y su posterior implantación en un entorno artificial que sea favorable para su supervivencia y/o crecimiento. Los requisitos ambientales fundamentales para un desarrollo celular óptimo son una temperatura controlada, un sustrato para la adhesión celular, un medio de cultivo adecuado y una incubadora que mantenga el pH y la osmolalidad óptimos. Las células deben contar con estas condiciones para crecer hasta alcanzar su máximo potencial.

La selección de un medio de crecimiento adecuado para el cultivo in vitro es la etapa del cultivo celular que resulta a la vez la más crítica y la más vital. Un medio de crecimiento, también conocido como medio de cultivo, es un líquido o gel formulado para fomentar el desarrollo de organismos a escala microscópica, celular o vegetal. El medio utilizado para cultivar células suele contener un suministro adecuado de energía y sustancias que regulan el ciclo celular. Los componentes principales de un medio de cultivo incluyen aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, glucosa y suero. El suero se agrega al medio porque actúa como fuente de factores de crecimiento, hormonas y factores de adhesión. Además de proporcionar nutrientes, el medio también contribuye al mantenimiento de los niveles de pH y osmolalidad.

Tipos de medios utilizados en el cultivo celular

Tanto las células humanas como las animales pueden cultivarse en un medio artificial o sintético, o bien en un medio totalmente natural complementado con elementos naturales. A continuación, te ofrecemos una visión general de los diferentes tipos de medios disponibles actualmente.

Medios naturales

En los medios naturales solo se pueden encontrar fluidos biológicos que existen en su estado natural. Los medios naturales son muy útiles y fáciles de usar para el cultivo de una amplia variedad de tipos de células animales. La falta de conocimiento sobre los componentes precisos que conforman los medios naturales es el principal factor que contribuye a la baja repetibilidad de los resultados obtenidos al utilizarlos.

Medios artificiales

La preparación de medios artificiales o sintéticos implica la adición de nutrientes (tanto orgánicos como inorgánicos), proteínas séricas, carbohidratos, cofactores, vitaminas y sales, así como las fases gaseosas de O₂ y CO₂ [1].

Se han desarrollado diversos tipos de medios artificiales con el fin de cumplir una o más de las siguientes funciones: 1) Supervivencia inmediata (una solución salina equilibrada con un pH y una presión osmótica precisos). 2) Supervivencia prolongada (una solución salina equilibrada suplementada con diferentes formulaciones de compuestos orgánicos y/o suero). 3) Desarrollo indefinido. 4) Funciones especializadas.

Existen cuatro clasificaciones distintas de medios artificiales:

Medios que contienen suero

El tipo de suplemento más frecuente que se encuentra en los medios utilizados para el cultivo de células animales es el suero fetal bovino. Se agrega al medio de cultivo como un suplemento de bajo costo con el fin de lograr las mejores condiciones de crecimiento posibles. Además de actuar como transportador o quelante de nutrientes inestables o insolubles en agua, hormonas y factores de crecimiento, inhibidores de proteasas y otras sustancias, el suero también se une a moléculas dañinas y las neutraliza.

Medios sin suero

La presencia de suero en los medios presenta varias desventajas y puede causar errores importantes en la interpretación de la investigación inmunológica [2, 3]. Se han creado diversos medios sin suero [4, 5]. Estos medios suelen estar formulados específicamente para facilitar el cultivo de un solo tipo de célula, como el Knockout Serum Replacement y el Knockout DMEM de Thermo Fisher Scientific, y el medio mTESR de Stem Cell Technologies [6], para células madre [7].

Además, estos medios incorporan cantidades definidas de factores de crecimiento purificados, lipoproteínas y otras proteínas, que de otra manera suelen ser aportadas por el suero [8]. A menudo se hace referencia a estos medios como «medios de cultivo definidos», ya que se conocen bien los componentes que los conforman.

Medios químicamente definidos

Estos medios incluyen componentes inorgánicos y orgánicos ultrapuros que no han sido afectados por ningún tipo de contaminación. También pueden incluir adiciones de proteínas puras, como los factores de crecimiento.

 La modificación genética de bacterias o levaduras, junto con la adición de ácidos grasos específicos, vitaminas, colesterol y aminoácidos, da como resultado la producción de sus componentes [9].

Medios libres de proteínas

Los medios libres de proteínas son aquellos que no contienen proteínas en absoluto y, en su lugar, solo incluyen elementos no proteicos. En comparación con los medios con suero agregado, el uso de medios sin proteínas agregadas promueve una mayor proliferación celular y expresión proteica, y facilita la purificación de cualquier producto generado en un proceso posterior [10-12]. Las proteínas no se incluyen en formulaciones como el MEM y el RPMI-1640. Sin embargo, se puede administrar un suplemento proteico si es necesario.

Medios de cultivo y sus componentes básicos

Los medios de cultivo comerciales pueden adquirirse en forma de polvo o líquido y, con frecuencia, incluyen una variedad de nutrientes, como aminoácidos, glucosa, sales, vitaminas y otros suplementos dietéticos. 

Las necesidades de estos componentes varían según cada línea celular, y estas variaciones explican la gran variedad de formulaciones de medios disponibles. Cada componente cumple una función específica, que se describirá en los siguientes párrafos:

Sistemas tampón

Para mantener condiciones óptimas de crecimiento, se debe controlar el pH, lo cual a menudo se logra mediante uno de dos sistemas tampón:

Sistema tampón natural

La proporción de CO₂/H₂CO₃ en la atmósfera es igual a la del medio, lo que crea un mecanismo tampón natural. Para preservar este mecanismo tampón natural, los cultivos deben mantenerse en un ambiente con un 5-10 % de CO₂, lo que a menudo se logra mediante el uso de una incubadora de CO₂. Una de las mejores ventajas de utilizar un tampón natural es lo económico y seguro que resulta.

HEPES

El tampón químico que utiliza el ión zwiteriónico HEPES tiene una mayor capacidad de tamponamiento en el rango de pH de 7,2 a 7,4 y no requiere un ambiente gaseoso regulado. Para ciertos tipos de células, una dosis mayor de HEPES puede resultar dañina. Los medios que contienen HEPES son, asimismo, mucho más susceptibles a los efectos fototóxicos de la luz fluorescente [13].

Rojo de fenol

El indicador de pH rojo de fenol suele incluirse en los medios de cultivo disponibles en el mercado, lo que permite un monitoreo continuo del pH. A medida que las células se multiplican, los metabolitos que producen provocan un cambio en el pH y, por lo tanto, un cambio de color en el medio. El rojo de fenol tiene un doble efecto sobre el color del medio: lo vuelve amarillo a un pH ácido y púrpura a un pH alcalino. Un pH de 7,4, el valor óptimo para el cultivo celular, hace que el medio adquiera un color rojo fluorescente.

Sin embargo, el rojo de fenol presenta algunas desventajas: en primer lugar, es capaz de simular la acción de varias hormonas esteroides, principalmente el estrógeno [14]. Por lo tanto, al estudiar células sensibles al estrógeno, como el tejido mamario, se recomienda utilizar un medio libre de rojo de fenol. La presencia de rojo de fenol en varias formulaciones sin suero altera el equilibrio de sodio-potasio. La adición de suero u hormona hipofisaria bovina a los medios puede contrarrestar este efecto [15]. En tercer lugar, la presencia de rojo de fenol dificulta la detección en experimentos de citometría de flujo.

Sales inorgánicas

Los medios que contienen sales inorgánicas, como iones de sodio, potasio y calcio, ayudan a mantener el equilibrio osmótico y a regular el potencial de membrana.

Aminoácidos

Dado que los aminoácidos son los componentes fundamentales de las proteínas, son un componente esencial de todos y cada uno de los medios de crecimiento celular que se han concebido. Debido a que las células no pueden producir ciertos aminoácidos por sí mismas, es importante que el medio de cultivo incluya aminoácidos esenciales. Son necesarios para la proliferación celular, y la concentración en la que se encuentran determina la densidad celular máxima que se puede alcanzar. En particular, la L-glutamina, un aminoácido esencial, es especialmente crucial.

La L-glutamina funciona como una fuente secundaria de energía para el metabolismo y aporta nitrógeno para la producción de NAD, NADPH y nucleótidos. Debido a que la L-glutamina es un aminoácido inestable que, con el tiempo, se transforma en una forma que las células no pueden utilizar, debe añadirse al medio.

Además, se pueden agregar aminoácidos no esenciales al medio para reponer aquellos que se han consumido durante el proceso de crecimiento. El crecimiento de las células se potencia y su viabilidad aumenta cuando el medio de cultivo se suplementa con aminoácidos no esenciales.

Carbohidratos

Los carbohidratos en forma de azúcares son la principal fuente de energía. Muchos de los medios también incluyen maltosa y fructosa, además de los azúcares más comunes como la glucosa y la galactosa.

Proteínas y péptidos

La albúmina, la transferrina y la fibronectina son las proteínas y los péptidos más utilizados. Son especialmente importantes en los medios que no contienen suero. La albúmina, la transferrina, la aprotinina, la fetuina y la fibronectina son algunas de las proteínas que pueden encontrarse en el suero, el cual es una rica fuente de proteínas.

La albúmina es la principal proteína presente en la sangre, y su función es unir y transportar diversas sustancias —como agua, sales, ácidos grasos libres, hormonas y vitaminas— entre los distintos órganos y células. La capacidad de la albúmina para unirse a sustancias químicas la convierte en una opción eficaz para eliminar compuestos nocivos del medio en el que se cultivan las células.

La aprotinina es un agente protector en los sistemas de cultivo celular, ya que es estable a pH neutro y ácido, además de ser resistente a altas temperaturas y a la destrucción que pueden causar las enzimas proteolíticas. Es capaz de inhibir varias proteasas de serina, incluida la tripsina, entre otras.

La fetuina es una glicoproteína que puede detectarse en cantidades más elevadas en el suero de animales fetales y recién nacidos en comparación con el suero de adultos. Además, actúa como inhibidor de las proteasas de serina. La proteína fibronectina es un componente esencial en el proceso de adhesión celular. La transferrina es una proteína que transporta hierro y se encarga de llevarlo a las membranas celulares.

Ácidos grasos y lípidos

Desempeñan un papel crucial en los medios libres de suero cuando este no está presente.

Vitaminas

Son necesarias numerosas vitaminas para el desarrollo y la proliferación celular. Las células no pueden producir vitaminas en cantidades suficientes, por lo que son esenciales en el cultivo de tejidos como suplementos dietéticos.

En el cultivo celular, el suero es la fuente principal de vitaminas; sin embargo, los medios también se enriquecen con diversas vitaminas para adaptarlos a un tipo específico de célula. Por lo general, las vitaminas del grupo B se utilizan para estimular el crecimiento.

Oligoelementos

Los elementos químicos como el cobre, el zinc, el selenio y los intermedios del ácido tricarboxílico se conocen como oligoelementos. A menudo se agregan oligoelementos a los medios que no contienen suero para reemplazar aquellos que suelen estar presentes en el suero. Estos elementos son componentes químicos importantes que se requieren para un desarrollo celular saludable. Muchas reacciones bioquímicas dependen de ciertos micronutrientes, como la actividad enzimática.

Suplementos para medios

El medio de crecimiento completo recomendado para ciertas líneas celulares requiere componentes adicionales que no se encuentran en los medios de referencia ni en el suero. Estos suplementos dietéticos favorecen el crecimiento celular y el funcionamiento metabólico adecuado.

Aunque las hormonas, los factores de crecimiento y las moléculas de señalización son esenciales para la proliferación adecuada de líneas celulares específicas, siempre se deben tomar las siguientes precauciones: Dado que la adición de suplementos podría alterar la osmolalidad del medio de crecimiento completo, lo cual puede inhibir el desarrollo celular, siempre es recomendable verificar la osmolalidad después de agregar los suplementos. Para la mayoría de las líneas celulares, la osmolalidad óptima oscila entre 260 y 320 mOSM/kg.

Antibióticos

Los antibióticos se emplean con frecuencia para inhibir el desarrollo de contaminantes bacterianos y fúngicos [16], aunque no son esenciales para el crecimiento celular. Dado que los antibióticos podrían ocultar la contaminación por micoplasmas y bacterias resistentes, no se recomienda su uso rutinario en el cultivo celular [17, 18].

Además, los antibióticos pueden alterar el metabolismo de las células hipersensibles. Se utilizan con frecuencia las combinaciones de penicilina y estreptomicina fabricadas por MilliporeSigma y Life Technologies. La plasmocina se ha utilizado en el cultivo de las líneas celulares de glioma TS603, TS516 y BT260 [19], y se ha demostrado su eficacia para eliminar la contaminación por micoplasmas (20).

Suero

En el suero se encuentran albúminas, factores de crecimiento e inhibidores del crecimiento. El suero es uno de los componentes más importantes del medio de cultivo celular, ya que aporta aminoácidos, proteínas, vitaminas (especialmente las liposolubles, como la A, la D, la E y la K), carbohidratos, lípidos, hormonas, factores de crecimiento, minerales y oligoelementos.

A menudo se utiliza suero de origen fetal y de ternero para promover el desarrollo de las células en cultivo. El suero fetal es una fuente abundante de factores de crecimiento y es adecuado para la clonación celular y el desarrollo de células sensibles. Debido a su menor capacidad para promover el crecimiento, el suero de ternero se emplea en experimentos de inhibición por contacto. Los medios de cultivo normales suelen incluir entre un 2 % y un 10 % de suero. La adición de suero al medio de cultivo tiene los siguientes propósitos [21]:

• El suero aporta los nutrientes esenciales para las células (tanto en solución como unidos a proteínas).

• El suero contiene varios factores de crecimiento y hormonas que participan en la promoción del crecimiento y en la actividad celular especializada.

• Ofrece muchas proteínas de unión, como la albúmina y la transferrina, que transportan otras sustancias químicas al interior de la célula. Por ejemplo, la albúmina transporta grasas, vitaminas, hormonas, etc., a las células.

• También aporta proteínas, como la fibronectina, que aumentan la adhesión celular al sustrato. Además, produce elementos de extensión que ayudan a la expansión celular antes de la división.

• Aporta inhibidores de proteasas que previenen la proteólisis en las células.

• También contiene minerales como Na+, K+, Zn2+ y Fe2+.

• Aumenta la viscosidad del medio, protegiendo así a las células de lesiones mecánicas durante la agitación del cultivo en suspensión.

• También actúa como tampón.

Referencias

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrición de células animales en cultivo de tejidos; estudios iniciales sobre un medio sintético. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Adsorción rápida de un componente del suero fetal bovino por células de mamíferos en cultivo. Una fuente potencial de artefactos en estudios de antisueros contra antígenos específicos de células. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. La adición de suero al medio utilizado para la preparación de suspensiones celulares como posible fuente de artefactos en reacciones mediadas por células estudiadas mediante la prueba del ganglio linfático poplíteo. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Medios comerciales sin suero: crecimiento de hibridomas y producción de anticuerpos monoclonales. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Métodos para el crecimiento de células en cultivo en medio sin suero. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vázquez Sánchez S, Tapia O, et al. Las chaperonas HSP70 transportan la TDP-43 libre de ARN a caparazones esféricas líquidas intranucleares anisotrópicas. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. La senescencia inducida por el síndrome de Down altera la arquitectura nuclear de los progenitores neurales. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Reemplazo completo del suero por albúmina, transferrina y lípidos de soya en cultivos de linfocitos B reactivos a lipopolisacáridos. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Mejora sistemática de un medio químicamente definido y libre de proteínas para el crecimiento de hibridomas y la producción de anticuerpos monoclonales. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Un medio libre de proteínas para el crecimiento de hibridomas y otras células del sistema inmunológico. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Cultivo celular sin suero: un enfoque unificador. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Crecimiento clonal de líneas celulares de hámster chino en medios libres de proteínas. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zúñiga J, Vistica B, Gery I. Análisis de los efectos citotóxicos del medio de cultivo que contiene HEPES expuesto a la luz. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. El rojo de fenol en los medios de cultivo de tejidos es un estrógeno débil: implicaciones para el estudio de células sensibles a los estrógenos en cultivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Desarrollo de medios sin suero. En: Master JRW, editor. Cultivo de células animales, 3.ª ed. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Uso de antibióticos en los medios de cultivo celular. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Propagación y control de la infección por micoplasmas en cultivos celulares. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Cambio de medio y pases de líneas celulares. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. La desmetilasa de histonas KDM6A detecta directamente el oxígeno para controlar la cromatina y el destino celular. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Eficacia de Plasmocin™ en diversas líneas celulares de mamíferos infectadas por mollicutes en comparación con antibióticos de uso común en cultivos celulares: una experiencia local. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Aspectos moleculares de la unión de ligandos a la albúmina sérica. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53