เซลล์ HaCaT

1. ทิ้งอาหารเลี้ยงเชื้อเก่า: นำอาหารเลี้ยงเชื้อเก่าออกจากขวดบ่มเชื้ออย่างระมัดระวัง
2. ล้างเซลล์: เติมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์เกลือ (PBS) ที่ไม่มีแคลเซียมและแมกนีเซียม 3-5 มิลลิลิตรลงในขวด T25 หรือ 5-10 มิลลิลิตรลงในขวด T75 เพื่อล้างเซลล์ที่เกาะติด
3. เติมสารละลาย EDTA: ปิดชั้นเซลล์ให้ทั่วด้วยสารละลาย EDTA 0.05% ที่เตรียมใหม่ ใช้ 1-2 มิลลิลิตรสำหรับขวด T25 และ 2.5 มิลลิลิตรสำหรับขวด T75
4. บ่ม: บ่มขวดแก้วที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 10 นาที
5. เติม Trypsin/EDTA หรือ TrypLE Express Solution: หลังจากบ่มแล้ว ให้เติมสารละลาย trypsin/EDTA ที่เตรียมใหม่ (0.05% trypsin, 0.025% EDTA) หรือ TrypLE Express ลงในขวดเพาะเลี้ยง โดยให้แน่ใจว่าชั้นเซลล์ถูกปกคลุมอย่างทั่วถึงใช้ 1 มล. สำหรับขวด T25 และ 2.5 มล. สำหรับขวด T75 (หมายเหตุ: สามารถข้ามขั้นตอนที่ 3 และ 4 ได้หากใช้ TrypLE Express)
6. การสังเกตการหลุดของเซลล์: สังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ เซลล์ควรหลุดออกภายใน 1-5 นาที
7. ทำให้ทริปซินเป็นกลาง: เติมอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีเซรั่มจากเลือดวัวตัวเมียที่ตั้งครรภ์ (FBS) เพื่อทำให้กิจกรรมของทริปซินเป็นกลางทันทีที่เซลล์หลุดออกจากกัน
8. ถ่ายเซลล์: ถ่ายสารแขวนลอยเซลล์ลงในขวดใหม่ซึ่งเติมอาหารเลี้ยงเชื้อสดไว้ล่วงหน้าแล้ว

1. ยืนยันว่าขวดยังคงแช่แข็งอย่างสมบูรณ์เมื่อได้รับสินค้า เนื่องจากเซลล์ถูกจัดส่งบนน้ำแข็งแห้งเพื่อรักษาอุณหภูมิที่เหมาะสมระหว่างการขนส่ง

2. เมื่อได้รับแล้ว ให้เก็บ cryovial ทันทีที่อุณหภูมิต่ำกว่า -150 องศาเซลเซียส เพื่อรักษาความสมบูรณ์ของเซลล์ หรือดำเนินการตามขั้นตอนที่ 3 หากจำเป็นต้องเพาะเลี้ยงทันที

3. สำหรับการเพาะเลี้ยงทันที ให้ละลายน้ำแข็งในหลอดอย่างรวดเร็วโดยแช่หลอดในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C พร้อมน้ำสะอาดและสารต้านจุลชีพ คนเบา ๆ เป็นเวลา 40-60 วินาที จนกระทั่งเหลือเพียงก้อนน้ำแข็งขนาดเล็ก

4. ดำเนินการขั้นตอนต่อไปทั้งหมดภายใต้สภาวะปลอดเชื้อในตู้ลมไหล โดยฆ่าเชื้อขวดแช่แข็งด้วยแอลกอฮอล์ 70% ก่อนเปิด

5. เปิดขวดยาฆ่าเชื้ออย่างระมัดระวัง และถ่ายโอนสารแขวนลอยเซลล์ลงในหลอดปั่นเหวี่ยงขนาด 15 มิลลิลิตรที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อที่อุณหภูมิห้อง 8 มิลลิลิตร โดยคนเบา ๆ

6. ปั่นเหวี่ยงส่วนผสมที่ความเร็ว 300 x g เป็นเวลา 3 นาที เพื่อแยกเซลล์ออกจากกัน แล้วเทส่วนใสที่อยู่ด้านบนซึ่งมีสารแช่แข็งตกค้างออกอย่างระมัดระวัง

7. ค่อยๆ ผสมเซลล์ที่ตกตะกอนให้ละลายในอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่ 10 มิลลิลิตร สำหรับเซลล์ที่เกาะติด ให้แบ่งสารแขวนลอยลงในขวดเลี้ยงเชื้อ T25 สองขวด สำหรับการเลี้ยงแบบแขวนลอย ให้ถ่ายอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งหมดลงในขวด T25 ขวดเดียว เพื่อส่งเสริมการปฏิสัมพันธ์และการเจริญเติบโตของเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพ

8. ปฏิบัติตามระเบียบปฏิบัติของกลุ่มวัฒนธรรมย่อยที่กำหนดไว้สำหรับการเติบโตและการบำรุงรักษาของเซลล์ไลน์อย่างต่อเนื่อง เพื่อให้มั่นใจในผลลัพธ์การทดลองที่เชื่อถือได้

37°C, 5%_CO2, บรรยากาศชื้น

สำหรับการยึดเกาะและการมีชีวิตที่ดีที่สุดหลังการละลาย เราแนะนำให้ใช้ขวดหรือจานเคลือบคอลลาเจน

เซลล์ไลน์ที่แช่แข็งในไนโตรเจนเหลวจะถูกจัดส่งในบรรจุภัณฑ์ที่ผ่านการตรวจสอบแล้วและมีการเก็บรักษาความเย็นด้วยน้ำแข็งแห้ง พร้อมสารทำความเย็นที่เพียงพอเพื่อรักษาอุณหภูมิประมาณ −78 °C ตลอดการขนส่ง เมื่อได้รับสินค้า ให้ตรวจสอบภาชนะทันทีและถ่ายโอนหลอดทดลองไปยังที่เก็บที่เหมาะสมโดยไม่ล่าช้า

เซลล์ไลน์ที่แช่แข็งในไนโตรเจนเหลวจะถูกจัดส่งในบรรจุภัณฑ์ที่ผ่านการตรวจสอบแล้วและมีการเก็บรักษาความเย็นด้วยน้ำแข็งแห้ง พร้อมสารทำความเย็นที่เพียงพอเพื่อรักษาอุณหภูมิประมาณ −78 °C ตลอดการขนส่ง เมื่อได้รับสินค้า ให้ตรวจสอบภาชนะทันทีและถ่ายโอนหลอดทดลองไปยังที่เก็บที่เหมาะสมโดยไม่ล่าช้า

สำหรับการเก็บรักษาในระยะยาว ให้วางหลอดบรรจุในไนโตรเจนเหลวในสถานะไอที่อุณหภูมิประมาณ −150 ถึง −196 °C การเก็บรักษาที่อุณหภูมิ −80 °C สามารถใช้ได้เฉพาะในระยะสั้นก่อนการย้ายไปยังไนโตรเจนเหลวเท่านั้น

การปนเปื้อนของไมโคพลาสมาถูกตัดออกโดยใช้ทั้งการทดสอบแบบ PCR และการตรวจหาไมโคพลาสมาโดยใช้วิธีการเรืองแสง

เพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อนของแบคทีเรีย เชื้อรา หรือยีสต์ การเพาะเลี้ยงเซลล์จะถูกตรวจสอบด้วยสายตาทุกวัน