Bunky HaCaT

1. Vyradenie starého média: Staré kultivačné médium opatrne odstráňte z banky.
2. Premyte bunky: Pridajte 3 - 5 ml fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) bez vápnika a horčíka do banky T25 alebo 5 - 10 ml do banky T75, aby ste opláchli priľnuté bunky.
3. Pridajte roztok EDTA: Vrstvu buniek úplne pokryte čerstvo pripraveným 0,05 % roztokom EDTA. Použite 1 - 2 ml pre banky T25 a 2,5 ml pre banky T75.
4. Inkubujte: Inkubujte banky pri teplote 37 °C počas 10 minút.
5. Pridajte roztok Trypsin/EDTA alebo TrypLE Express: Po inkubácii pridajte do banky čerstvo pripravený roztok trypsínu/EDTA (0,05 % trypsín, 0,025 % EDTA) alebo TrypLE Express, pričom zabezpečte, aby bola vrstva buniek úplne pokrytá. Použite 1 ml pre banky T25 a 2,5 ml pre banky T75. (Poznámka: Ak používate TrypLE Express, kroky 3 a 4 môžete vynechať.)
6. Monitorujte oddeľovanie: Pozorujte bunky pod mikroskopom. Bunky by sa mali oddeliť do 1-5 minút.
7. Neutralizujte trypsín: Pridajte médium bunkovej kultúry obsahujúce fetálne hovädzie sérum (FBS), aby ste neutralizovali aktivitu trypsínu hneď po oddelení buniek.
8. Preneste bunky: Bunková suspenzia sa preleje do nových fliaš vopred naplnených čerstvým kultivačným médiom.

1. Overte si, že injekčná liekovka zostane pri doručení hlboko zmrazená, pretože bunky sa prepravujú na suchom ľade, aby sa počas prepravy udržala optimálna teplota.

2. Po prijatí buď okamžite uskladnite kryovialku pri teplote nižšej ako -150 °C, aby ste zabezpečili zachovanie bunkovej integrity, alebo prejdite na krok 3, ak je potrebná okamžitá kultivácia.

3. V prípade okamžitej kultivácie injekčnú liekovku rýchlo rozmrazte ponorením do vodného kúpeľa s teplotou 37 °C s čistou vodou a antimikrobiálnym prostriedkom, pričom ju jemne miešajte 40 - 60 sekúnd, kým nezostane malý ľadový chumáč.

4. Všetky ďalšie kroky vykonajte v sterilných podmienkach v prietokovom digestore a pred otvorením kryovialku dezinfikujte 70 % etanolom.

5. Opatrne otvorte dezinfikovanú fľaštičku a preneste bunkovú suspenziu do 15 ml centrifugačnej skúmavky obsahujúcej 8 ml kultivačného média s izbovou teplotou a jemne premiešajte.

6. Zmes odstreďujte pri 300 x g počas 3 minút, aby sa bunky oddelili, a opatrne zlikvidujte supernatant obsahujúci zvyšky zmrazovacieho média.

7. Pelet buniek jemne resuspendujte v 10 ml čerstvého kultivačného média. V prípade adherentných buniek rozdeľte suspenziu medzi dve kultivačné banky T25; v prípade suspenzných kultúr preneste všetko médium do jednej banky T25, aby ste podporili účinnú interakciu a rast buniek.

8. Dodržiavajte zavedené subkultivačné protokoly na nepretržitý rast a udržiavanie bunkovej línie, čím sa zabezpečia spoľahlivé výsledky experimentov.

37 °C, 5 %_CO2, zvlhčená atmosféra.

Na dosiahnutie optimálneho uchytenia a životaschopnosti po rozmrazení odporúčame používať banky alebo platne s kolagénom.

Kryokonzervované bunkové línie sa prepravujú na suchom ľade v overených, izolovaných obaloch s dostatočným množstvom chladiva na udržanie teploty približne -78 °C počas celej prepravy. Po prijatí ihneď skontrolujte obal a bezodkladne premiestnite injekčné liekovky do vhodného skladu.

Kryokonzervované bunkové línie sa prepravujú na suchom ľade v overených, izolovaných obaloch s dostatočným množstvom chladiva na udržanie teploty približne -78 °C počas celej prepravy. Po prijatí ihneď skontrolujte obal a bezodkladne premiestnite injekčné liekovky do vhodného skladu.

Na dlhodobé uchovávanie umiestnite injekčné liekovky do kvapalnej fázy dusíka v pare pri teplote približne -150 až -196 °C. Skladovanie pri teplote -80 °C je prijateľné len ako krátky prechodný krok pred presunom do tekutého dusíka.

Kontaminácia mykoplazmami sa vylučuje pomocou testov založených na PCR a metód detekcie mykoplaziem založených na luminiscencii.

Aby sa zabezpečilo, že nedošlo ku kontaminácii baktériami, hubami alebo kvasinkami, bunkové kultúry sa denne vizuálne kontrolujú.