Techniki dysocjacji hodowli komórkowych

Dysocjacja hodowli komórkowej jest krytycznym krokiem w utrzymaniu hodowli komórkowej. Obejmuje ona odłączenie komórek od ich powierzchni wzrostu w celu umożliwienia podhodowli lub zbioru. W tej sekcji opisano dwie główne metody: stosowanie buforów dysocjacyjnych niezawierających enzymów i stosowanie odczynników enzymatycznych.

1.stosowanie buforów do dysocjacji komórek bez enzymów

Metoda ta jest delikatna i utrzymuje integralność komórkową bez użycia enzymów:

1. Przygotowanie
   • Upewnij się, że wszystkie odczynniki są ogrzane do 37°C przed użyciem, aby uniknąć szoku dla komórek.
2. Usunięcie pożywki wzrostowej
   • Wyrzucić starą pożywkę z naczynia hodowlanego.
3. Płukanie
   • Przepłukać monowarstwy komórek 5 ml wolnego od wapnia i magnezu PBS na kolbę T75 lub szalkę 100 mm.
   • Delikatnie wstrząsać naczyniem przez 30-60 sekund w temperaturze pokojowej.
   • Odessać i wyrzucić roztwór do płukania.
   • Powtórz ten etap płukania jeszcze raz.
4. Dysocjacja
   • Dodaj około 5 ml wolnego od enzymów buforu do dysocjacji komórek do naczynia.
   • Delikatnie wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 1 do 2 minut i sprawdzić dysocjację pod mikroskopem.
   • W razie potrzeby uderz kolbą lub naczyniem o dłoń, aby usunąć komórki.
   • Jeśli komórki przylegają, pozostaw je w temperaturze pokojowej na dodatkowe 2 do 5 minut i w razie potrzeby ponownie stuknij, używając większej ilości buforu dysocjacyjnego.
   • Po odłączeniu komórek dodać co najmniej 5 ml kompletnego podłoża wzrostowego, aby zneutralizować bufor dysocjacyjny i ponownie zawiesić komórki.
5. Kontrola żywotności
   • Monitoruj żywotność komórek podczas subkulturowania, upewniając się, że utrzymuje się ona na poziomie powyżej 90%.

2.używanie innych odczynników do dysocjacji

Ta metoda pozwala na użycie różnych odczynników do dysocjacji:

1. Usuwanie zużytej pożywki
   • Wyrzucić starą pożywkę z naczynia hodowlanego.
2. Płukanie komórek
   • Przemyć komórki zrównoważonym roztworem soli wolnym od wapnia i magnezu lub użyć EDTA.
   • Delikatnie dodaj roztwór płuczący po stronie przeciwnej do komórek i wstrząsaj naczyniem przez 1 do 2 minut przed wyrzuceniem roztworu płuczącego.
3. Dysocjacja
   • Nałożyć 2 do 3 ml wybranego roztworu dysocjacyjnego na 25 cm² powierzchni wzrostu, zapewniając pokrycie arkusza komórek.
   • Inkubować naczynie w temperaturze 37°C i delikatnie wstrząsać. Dysocjacja następuje zazwyczaj w ciągu 5 do 15 minut, w zależności od linii komórkowej.
   • W przypadku opornych komórek stukanie w naczynie może przyspieszyć ten proces.
   • Uważnie obserwuj komórki, aby zapobiec nadmiernej ekspozycji i potencjalnym uszkodzeniom.
4. Zbieranie komórek
   • Po całkowitym odłączeniu komórek, pozwól im zebrać się na dnie naczynia, ustawiając je pionowo.
   • Dodaj pełną pożywkę, a następnie zdysperguj i zbierz komórki, pipetując nad warstwą komórek.
   • Policzyć i kontynuować subkulturę.

W obu metodach ważne jest określenie optymalnych warunków dla każdej linii komórkowej poprzez obserwację empiryczną. Proces powinien zachować żywotność komórek, która powinna być rutynowo sprawdzana, aby przekroczyć 90% podczas podhodowli. Procedury te stanowią podstawę dla badaczy do dostosowania w oparciu o specyficzne wymagania i cechy ich linii komórkowych.

3.przegląd technik subhodowli komórek adherentnych

Skuteczna subkultura komórek adherentnych wymaga ich odłączenia od naczynia hodowlanego. Stosowane są różne metody, z których każda jest odpowiednia dla różnych typów komórek i warunków. Wybierając metodę dysocjacji, należy wziąć pod uwagę specyficzne potrzeby linii komórkowej i cele eksperymentu. Regularne monitorowanie żywotności komórek, w celu uzyskania ponad 90% w czasie subkultury, jest niezbędne dla utrzymania zdrowia i wydajności hodowli. Poniżej znajduje się przegląd tych procedur: