Opublikowano: 2023 r. | Ostatnia aktualizacja: maj 2026 r.
Kompleksowy przewodnik po zamrażaniu komórek: zapewnienie żywotności i sterylności
Zamrażanie komórek to kluczowy proces w zarządzaniu hodowlami komórkowymi, który pozwala na długoterminowe przechowywanie i konserwację cennych linii komórkowych. Niezależnie od tego, czy pracujesz z komórkami ludzkimi, czy zwierzęcymi, przestrzeganie dokładnych protokołów i utrzymywanie ścisłych technik aseptycznych ma kluczowe znaczenie dla udanej kriokonserwacji.
Niniejszy przewodnik zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące niezbędnych materiałów, odczynników oraz procedur krok po kroku, pozwalających skutecznie zamrażać komórki przy zachowaniu ich żywotności i sterylności. Przestrzegając tych wytycznych, naukowcy mogą bez obaw przechowywać, a następnie reaktywować hodowle komórkowe przy minimalnej utracie żywotności komórek, zachowując integralność i wiarygodność wyników eksperymentów.
Na początek konieczne jest stworzenie sterylnego środowiska pracy. Prawidłowe techniki aseptyczne odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu zanieczyszczeniom i zapewnieniu sterylności kultur.
Technika aseptyczna
Przez cały proces należy stosować techniki aseptyczne, aby zapewnić sterylność kultur.
Kompleksowy proces zamrażania komórek
Ten schemat blokowy stanowi szczegółowy przewodnik wizualny przedstawiający podstawowe etapy prawidłowego zamrażania komórek. Należy przestrzegać tych procedur, aby zapewnić wysoką żywotność i integralność komórek podczas procesu kriokonserwacji.
Przygotowanie pożywki do zamrażania
Przygotuj krioprotekcyjne medium do zamrażania zgodnie z typem komórek:
- Hodowle w pożywkach zawierających FBS: 90% FBS + 10% DMSO lub 70% pożywki wzrostowej, 20% FBS i 10% DMSO
- Komórki wymagające glicerolu: 90% FBS + 10% glicerolu
Rozważ zakup naszego gotowego podłoża do zamrażania:
- Środek do zamrażania CM-1: Do protokołów wymagających środka zawierającego surowicę płodową bydlęcą (FBS)
- Pożywka do zamrażania CM-ACF – bez surowicy: jako alternatywa bez FBS
Etykietowanie i dokumentacja
Oznacz probówki kriogeniczne, podając następujące informacje:
- Data
- Imię i nazwisko badacza
- Numer komórek
- Numer pasażowania
- Typ komórek
- Wszelkie dodatkowe informacje (np. modyfikacje genetyczne)
Przygotowanie komórek
W przypadku komórek przylegających:
- Monitoruj komórki, aż osiągną 85–95% konfluencji
- Odessać stare podłoże hodowlane
- Przepłucz monowarstwę komórek roztworem PBS bez wapnia i magnezu
- Oddziel komórki za pomocą Accutase, trypsyny lub trypsyny z EDTA i w razie potrzeby zneutralizuj je pożywką hodowlaną
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki Falcon o pojemności 50 ml
W przypadku komórek w zawiesinie:
- Sprawdź gęstość i stan komórek pod mikroskopem
- Przenieść zawiesinę komórek bezpośrednio do probówki Falcon o pojemności 50 ml
Zliczanie komórek i wirowanie
- Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek
- Odwirować przy 300 g przez 3–5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórek
- Ostrożnie odessać supernatant, unikając naruszenia osadu komórek
- Przed użyciem ogrzej przygotowane medium do zamrażania do temperatury 37°C
Kriokonserwacja
- Zresuspensuj osad komórek w pożywce do zamrażania do gęstości 2,0 mln komórek/ml dla komórek przylegających i 5 mln komórek/ml dla komórek w zawiesinie lub do pożądanego stężenia
- Przefiltrować 1,0 ml (lub więcej w razie potrzeby) zawiesiny komórek do oznaczonych probówek kriogenicznych
- Przed przeniesieniem komórek do przechowywania długoterminowego należy zastosować metodę powolnego zamrażania
- ? Metoda
- ? Etapy
-
❄️
Zamrażanie ręczne -
1️⃣ Umieść komórki w pożywce do zamrażania w zamrażarce w temperaturze 4°C na 40 minut.
2️⃣ Przenieś do zamrażarki w temperaturze -80°C na 24 godziny.
3️⃣ Przechowuj komórki w ciekłym azocie w celu długoterminowej konserwacji. -
?
Korzystanie z urządzenia Mr. Frosty -
1️⃣ Przygotuj komórki w krioprobówkach z pożywką do zamrażania.
2️⃣ Umieść krioprobówki w pojemniku Mr. Frosty.
3️⃣ Przechowuj w temperaturze -80°C przez 24 godziny przed przeniesieniem do ciekłego azotu. -
?
Zamrażarka o kontrolowanej szybkości -
1️⃣ Zaprogramuj urządzenie tak, aby stopniowo obniżało temperaturę.
2️⃣ Umieść przygotowane komórki w zamrażarce.
3️⃣ Po zakończeniu cyklu zamrażania przenieś komórki do ciekłego azotu.
- W celu długotrwałego przechowywania przechowuj probówki kriogeniczne w temperaturze poniżej -130°C lub w ciekłym azocie.
Materiały i odczynniki
- Krioprobówki o pojemności 1–2 ml
- Urządzenie do zamrażania CoolCell® lub zamrażarka o kontrolowanej szybkości
- Środek krioprotekcyjny do zamrażania (np. domowe środki krioprotekcyjne, CM-1, CM-ACF lub specjalistyczne pożywki)
- Surowica płodowa bydlęca (FBS) lub pożywki kondycjonowane
- DMSO lub glicerol
- PBS bez wapnia i magnezu
- Accutase, trypsyna lub trypsyna-EDTA (dla komórek przylegających)
- Probówki Falcon o pojemności 15 ml lub 50 ml
- Hemocytometr lub automatyczny licznik komórek
- Wirówka