Kompleksowy przewodnik po zamrażaniu komórek: Zapewnienie żywotności i sterylności
Zamrażanie komórek jest kluczowym procesem w zarządzaniu kulturami komórkowymi, zapewniającym długoterminowe przechowywanie i konserwację cennych linii komórkowych. Niezależnie od tego, czy pracujemy z komórkami ludzkimi, czy zwierzęcymi, przestrzeganie precyzyjnych protokołów i utrzymywanie ścisłych technik aseptycznych ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia udanej kriokonserwacji.
Niniejszy przewodnik zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące niezbędnych materiałów, odczynników i procedur krok po kroku, aby skutecznie zamrozić komórki, zachowując ich żywotność i sterylność. Stosując się do tych wytycznych, badacze mogą bezpiecznie przechowywać i później ożywić kultury komórkowe przy minimalnej utracie żywotności komórek, zachowując integralność i wiarygodność wyników swoich eksperymentów.
Na początek niezbędne jest stworzenie sterylnego środowiska pracy. Właściwe techniki aseptyczne odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu zanieczyszczeniom i zapewnianiu sterylności kultur.
Technika aseptyczna
Postępuj zgodnie z technikami aseptycznymi podczas całego procesu, aby zapewnić sterylność kultur.
Kompleksowy proces zamrażania komórek
Ten schemat blokowy zapewnia szczegółowy wizualny przewodnik po podstawowych krokach związanych z prawidłowym zamrażaniem komórek. Postępuj zgodnie z tymi procedurami, aby zapewnić wysoką żywotność i integralność komórek podczas procesu kriokonserwacji.
Przygotowanie pożywki do zamrażania
Przygotuj krioprotekcyjną pożywkę do zamrażania zgodnie z typem komórek:
- Kultury z pożywką zawierającą FBS: 90% FBS + 10% DMSO lub 70% pożywki wzrostowej, 20% FBS i 10% DMSO
- Komórki wymagające glicerolu: 90% FBS + 10% glicerolu
Rozważ zakup naszej wstępnie przygotowanej pożywki do zamrażania:
- Pożywka do wymrażania CM-1: Do protokołów wymagających pożywki zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS)
- Medium do zamrażania CM-ACF - bez surowicy: Alternatywa bez FBS
Etykietowanie i dokumentacja
Fiolki należy oznakować następującymi informacjami:
- Data
- Imię i nazwisko badacza
- Numer komórki
- Numer przejścia
- Typ komórki
- Wszelkie dodatkowe informacje (np. modyfikacje genetyczne)
Przygotowanie komórek
Dla komórek przylegających:
- Monitoruj komórki, aż osiągną 85-95% konfluencji
- Odessać starą pożywkę hodowlaną
- Przepłukać monowarstwę komórek PBS niezawierającym wapnia i magnezu
- Oddzielić komórki za pomocą Accutase, trypsyny lub trypsyny-EDTA i w razie potrzeby zneutralizować pożywką hodowlaną
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki Falcon o pojemności 50 ml
Dla komórek w zawiesinie:
- Sprawdzić gęstość i stan komórek pod mikroskopem
- Przenieś zawiesinę komórek bezpośrednio do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml
Liczenie komórek i wirowanie
- Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek
- Wirować z prędkością 300 g przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadu komórek
- Ostrożnie odessać supernatant, unikając naruszenia osadu komórek
- Przed użyciem podgrzać przygotowaną pożywkę do zamrażania do temperatury 37°C
Kriokonserwacja
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do zamrażania do gęstości 2,0 mln komórek/ml w przypadku komórek przylegających i 5 mln komórek/ml w przypadku komórek zawiesinowych lub do pożądanego stężenia
- Pobrać 1,0 ml (lub więcej w zależności od potrzeb) zawiesiny komórek do oznakowanych fiolek do zamrażania
- Użyj metody powolnego zamrażania przed przeniesieniem komórek do długoterminowego przechowywania
| ? Metoda | ? Kroki |
|---|---|
|
❄️ Ręczne zamrażanie |
1️⃣ Umieścić komórki w pożywce do zamrażania w temperaturze 4°C na 40 minut. 2️⃣ Przenieść do zamrażarki o temperaturze -80°C na 24 godziny. 3️⃣ Przechowywać komórki w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania |
|
? Używanie Mr. Frosty |
1️⃣ Przygotuj komórki w kriofiolach z pożywką do zamrażania. 2️⃣ Umieścić fiolki w pojemniku Mr. Frosty. 3️⃣ Przechowywać w temperaturze -80°C przez 24 godziny przed przeniesieniem do ciekłego azotu |
|
? Zamrażarka z kontrolowaną prędkością |
1️⃣ Zaprogramuj urządzenie tak, aby stopniowo obniżało temperaturę. 2️⃣ Umieść przygotowane komórki w zamrażarce. 3️⃣ Po cyklu zamrażania przenieś komórki do ciekłego azotu |
- Przechowuj kriofiole w temperaturze poniżej -130°C lub w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania.
Materiały i odczynniki
- fiolki o pojemności 1-2 ml
- Urządzenie do zamrażania CoolCell® lub zamrażarka o kontrolowanej prędkości
- Krioprotekcyjne podłoże do zamrażania (np. podłoże krioprotekcyjne DIY, CM-1, CM-ACF lub podłoże specjalistyczne)
- Płodowa surowica bydlęca (FBS) lub pożywka kondycjonowana
- DMSO lub glicerol
- PBS niezawierający wapnia i magnezu
- Accutase, Trypsin lub Trypsin-EDTA (dla komórek przylegających)
- probówki typu Falcon o pojemności 15 ml lub 50 ml
- Hemocytometr lub automatyczny licznik komórek
- Wirówka