Komórki HaCaT - badanie biologii i chorób skóry

2.charakterystyka genetyczna i pochodzenie komórek HaCaT

Komórki HaCaT są spontanicznie unieśmiertelnioną ludzką linią komórek keratynocytów pochodzącą z dorosłej skóry i reprezentującą unikalną ścieżkę ewolucyjną. Komórki te posiadają mutacje w obu allelach genu p53, co jest typowe dla mutacji indukowanych promieniowaniem UV [3,4]. Ponadto zakłada się, że komórki HaCaT powstały w wyniku mutacji genu supresorowego nowotworu p53, a następnie utraty genów senescencji [5].

Gen supresorowy nowotworu p53, znany ze swojej roli w naprawie DNA i jako strażnik genomu, indukuje odpowiedź ludzkiej skóry na uszkodzenia DNA [4]. Zaobserwowano, że komórki HaCaT częściowo utraciły swój mechanizm ochrony przed uszkodzeniami DNA z powodu mutacji in vivo genu p53, co czyni je podatnymi na akumulację zmian cytogenetycznych w odpowiedzi na podwyższone temperatury hodowli. Inny mechanizm immortalizacji komórek HaCaT obejmuje zwiększoną aktywność enzymu telomerazy [7]. W normalnych komórkach telomery stale skracają się z każdym podziałem komórkowym, aż do osiągnięcia starzenia komórkowego. Telomeraza jest wyspecjalizowanym kompleksem enzymów komórkowych o aktywności odwrotnej transkryptazy, który utrzymuje stabilną długość telomerów. Natomiast komórki HaCaT wykazują znacznie zwiększoną aktywność telomerazy, co skutkuje dobrze utrzymaną długością telomerów. Obserwacje te potwierdzają rolę telomerazy w procesie immortalizacji komórek HaCaT.

Zidentyfikowano trzy specyficzne translokacje chromosomowe, które powodują utratę jednej kopii ramion chromosomów 3p, 4p i 9p, zysk 9q i tworzenie izochromosomów. Utrata krótkiego ramienia chromosomu 3p może prowadzić do utraty genów starzenia i unieśmiertelnienia komórek HaCaT [8]. Komórki HaCaT są hipodiploidalne i posiadają odrębne i stabilne chromosomy markerowe reprezentujące ich monoklonalne pochodzenie. Charakterystyka i głowa linii komórkowej HaCaT zostały potwierdzone przy użyciu odcisków palców DNA z hiperzmiennymi markerami minisatelitarnymi [3-6].

3.jak zebrać komórki HaCaT w 5 prostych krokach

4. Usunąć podłoże hodowlane i przepłukać przylegające komórki za pomocą 3-5 ml PBS bez wapnia i magnezu w przypadku kolb T25 lub 5-10 ml w przypadku kolb T75.
5. Dodaj 1-2 ml świeżo przygotowanego 0,05% roztworu EDTA na kolbę T25 lub 2,5 ml na kolbę T75, upewniając się, że cały arkusz komórek jest pokryty i inkubuj w temperaturze 37°C przez 10 minut.
6. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego roztworu trypsyny/EDTA (0,05%/0,025%) na kolbę T25 lub 2,5 ml na kolbę T75, ponownie zapewniając całkowite pokrycie arkusza komórek. Komórki powinny oddzielić się w ciągu 1-2 minut.
7. Zatrzymać aktywność trypsyny poprzez dodanie pożywki zawierającej FBS.
8. Przenieś komórki do nowych kolb zawierających świeżą pożywkę do hodowli komórkowej.

4. Zastosowania komórek HaCaT

Komórki HaCaT są cennym narzędziem do badania keratynocytów [9]. Te nieśmiertelne komórki funkcjonują jako komórki przednowotworowe i mogą zapewnić wgląd w zmiany związane z transformacją złośliwą i nowotworową [10]. Hodowle jednowarstwowe komórek HaCaT są niezbędne do analizy toksyczności komórkowej i gojenia się ran in vitro. Komórki HaCaT mogą być również wykorzystywane do oceny toksyczności skóry spowodowanej różnymi czynnikami i procesami nowotworowymi lub zapalnymi. Mogą być wykorzystywane do analizy różnych mechanizmów skórnych reakcji alergicznych, wpływu reaktywnych form tlenu i napromieniowania UV. Po stymulacji komórki HaCaT mogą różnicować się i wyrażać specyficzne markery różnicowania, takie jak inwolukryna, K14 i K10. Komórki HaCaT są również powszechnie stosowane jako model do badania patofizjologii homeostazy naskórka [6].

Komórki HaCaT zachowują zdolność do odtwarzania ustrukturyzowanego naskórka in vivo po transplantacji, co skutkuje warstwową strukturą naskórka, która może być odwracana między stanem podstawowym a zróżnicowanym poprzez zmiany stężenia wapnia w pożywce. Komórki te pozwalają również na scharakteryzowanie kilku procesów biologicznych, takich jak ich wykorzystanie jako modelowego systemu witaminy D i metabolizmu w skórze. Ponieważ komórki HaCaT nie są modyfikowane genetycznie, prezentują one bezstronny obraz szerokiego spektrum początkowych zdarzeń genetycznych w ludzkiej skórze.

5. Polecane filmy wideo: Odkrywanie świata komórek HaCaT

"Migracja komórek HaCaT": Ten film przedstawia proces migracji komórek HaCaT. Migracja komórek jest niezbędnym procesem w różnych procesach biologicznych, takich jak gojenie się ran i przerzuty nowotworowe. Film demonstruje ruch komórek HaCaT pod mikroskopem, zapewniając wizualną reprezentację migracji tych komórek. Aktywność komórek jest obserwowana, gdy przemieszczają się one z jednej lokalizacji do drugiej, a wideo zapewnia wyraźną ilustrację zmian zachodzących w komórkach podczas tego procesu.

"Test zdrapywania przeprowadzonyna komórkach HaCaT": Ten film przedstawia test Scratch przeprowadzony na komórkach HaCaT. Scratch Assay jest szeroko stosowaną techniką do badania migracji komórek, a w tym przypadku służy do analizy migracji komórek HaCaT. Film demonstruje proces tworzenia rysy na powierzchni naczynia do hodowli komórkowej, która jest następnie obserwowana pod mikroskopem, gdy komórki HaCaT migrują i zamykają lukę w czasie.

"Wzrost komórek keratynocytów HaCaT na potrzeby eksperymentów gojenia ran": Ten film demonstruje proces wzrostu komórek keratynocytów HaCaT na potrzeby eksperymentów gojenia ran. Keratynocyty HaCaT są powszechnie stosowaną linią komórkową w badaniach nad gojeniem się ran.

"Różnicowanie komórek HaCaT": Ten film przedstawia kroki niezbędne do różnicowania komórek HaCaT. Komórki HaCaT mogą różnicować się w różne typy komórek skóry. Film demonstruje zmiany zachodzące w komórkach HaCaT podczas ich różnicowania, wizualnie przedstawiając różne markery i cechy różnicowania. Proces różnicowania ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania skóry, a film podkreśla różne etapy różnicowania, które przechodzą komórki HaCaT.

Odniesienia

1. Angel P i Karin M: Rola Jun, Fos i kompleksu AP-1 w proliferacji i transformacji komórek. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analysing qualitative data. Zestaw do badań jakościowych Sage. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Projektowanie badań stosowanych: praktyczny przewodnik. Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol.(1988);106:761-771.