U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 šūnas
800,00 €*
Produkti tiek piegādāti sasaldēti sausā ledū kriotubās. Katra kriotuba parasti satur 3 × 10 6 šūnas adhezīvām līnijām vai 5 × 106 šūnas suspensijas līnijām (sīkāka informācija atrodama partijas CoA).
Vispārīga informācija
| Apraksts | U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 ir genomā rediģēta cilvēka osteosarkomas šūnu līnija, kas iegūta no U2OS šūnām, kurās endogēnais SEH1L (SEH1) gēns ir modificēts, izmantojot CRISPR/Cas9 tehnoloģiju, lai kodētu in-frame SNAPf tagu. SEH1 ir Y-kompleksa (pazīstams arī kā NUP107-160 komplekss) komponents, kas ir kodola poru kompleksa (NPC) galvenais strukturālais modulis, kas veicina poru skeleta montāžu un stabilitāti. Ievietojot SNAPf kodējošo sekvenci endogēnajā lokusā, marķētā SEH1 proteīna ekspresija notiek saskaņā ar dabisko regulējošo kontroli, saglabājot fizioloģiskos ekspresijas līmeņus un minimizējot traucējumus kodola poru sastāvā. SNAPf marķieris ir inženierijas izstrādāts, ātri reaģējošs SNAP marķiera variants, kas kovalenti saistās ar benzilguanīna konjugētiem substrātiem, ļaujot selektīvi un stabili marķēt dzīvas vai fiksētas šūnas ar fluorescences marķieri. U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 šūnās fūzijas proteīns lokalizējas kodola apvalkā punktveida modelī, kas ir raksturīgs NPC izplatībai. Tā kā marķēšana notiek endogēno proteīnu līmenī, šī sistēma ir labi piemērota kvantitatīvai fluorescences mikroskopijai, superizšķirtspējas attēlveidošanai un vienu daļiņu izsekošanas analīzēm, kuru mērķis ir izpētīt NPC organizāciju un stehiometriju. U2OS šūnu plakana morfoloģija un lielie kodoli vēl vairāk atvieglo kodola apvalka struktūru vizualizāciju augstā izšķirtspējā. SEH1 piedalās NPC biogēnēzē un ir iesaistīts arī kinetohoru saistītajos procesos mitozes laikā. Tādējādi šī šūnu līnija nodrošina stabilu platformu, lai pētītu šūnu cikla atkarīgo NPC montāžu un demontāžu, Y kompleksa telpisko organizāciju poru skeleta ietvaros un SEH1 potenciālo dubulto lomu kodola apvalkā un mitotiskajos kinetohoros. U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 ļauj veikt mehāniskos pētījumus par kodola poru arhitektūru un dinamiku fizioloģiski atbilstošos ekspresijas apstākļos. |
|---|---|
| Organisms | Cilvēks |
| Audu | Bone |
| Slimība | Osteosarkoma |
Raksturojums
| Vecums | 15 gadi |
|---|---|
| Dzimums | Sievietes |
| Etniskā piederība | Kaukāzietis |
| Morfoloģija | Epitēlijveidīgs |
| Augšanas īpašības | Adherent |
Normatīvie dati
| Citāts | U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 (Cytion kataloga numurs 300664) |
|---|---|
| Bioloģiskās drošības līmenis | 1 |
| NCBI_TaxID | 9606 |
| Noguldītājs | Ellenberga laboratorija (EMBL) |
| ĢMO statuss | GMO-S1: Šī cilvēka osteosarkomas šūnu līnija (U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1) satur CRISPR mediētu SNAPf-SEH1 saplūšanu, kas nodrošina SEH1 nukleoporīna selektīvu marķēšanu. Šī modifikācija ir stabila. Šī klasifikācija attiecas tikai uz Vāciju un var atšķirties citur. |
Biomolekulārie dati
| Proteīnu ekspresija | SEH1, SNAPf-tag |
|---|
Darbs ar
| Kultūras barotne | McCoys 5a, w: 3,0 g/l glikoze, w: stabils glutamīns, w: 2,0 mM nātrija piruvāts, w: 2,2 g/l NaHCO3 (Cytion izstrādājuma numurs 820200a) |
|---|---|
| Papildinājumi | Papildināt barotni ar 10% FBS, 3,0 g/l glikozes, stabilu glutamīnu, 2,0 mM nātrija piruvāta, 2,2 g/l NaHCO3, 1% NEAA |
| Disociācijas reaģents | Accutase |
| Subkultivēšana | Noņemt veco barotni no pielipušajām šūnām un mazgāt tās ar PBS, kurā nav kalcija un magnija. T25 kolbām izmantojiet 3-5 ml PBS, bet T75 kolbām - 5-10 ml. Pēc tam pilnībā pārklājiet šūnas ar Accutase, izmantojot 1-2 ml T25 kolbām un 2,5 ml T75 kolbām. Ļaujiet šūnām inkubēties istabas temperatūrā 8-10 minūtes, lai tās atdalītos. Pēc inkubācijas uzmanīgi samaisiet šūnas ar 10 ml barotnes, lai tās atkārtoti suspendētu, pēc tam centrifugējiet 3 minūtes ar 300xg. Izmetiet supernatantu, atkārtoti suspendējiet šūnas svaigā barotnē un pārvietojiet tās jaunās kolbās, kurās jau ir svaiga barotne. |
| Vidēja sasaldēšanas pakāpe | Kā kriokonservēšanas barotni mēs izmantojam pilnvērtīgu augšanas barotni (ieskaitot FBS) + 10 % DMSO, lai nodrošinātu pietiekamu dzīvotspēju pēc atkausēšanas, vai CM-1 (Cytion kataloga numurs 800100), kas ietver optimizētus osmoprotektorus un metaboliskos stabilizatorus, lai uzlabotu atveseļošanos un samazinātu krioinducēto stresu. |
| Šūnu atkausēšana un kultivēšana |
|
| Inkubācijas atmosfēra | 37°C, 5%CO2, mitrināta atmosfēra. |
| Flakona pārklājums | Optimālai piestiprināšanai un dzīvotspējai pēc atkausēšanas ieteicams izmantot ar kolagēnu pārklātas kolbas vai plates. |
| Sasaldēšanas procedūra | Kriokonservētas šūnu līnijas tiek sūtītas uz sausā ledus apstiprinātā, izolētā iepakojumā ar pietiekamu dzesēšanas šķidruma daudzumu, lai visā transportēšanas laikā uzturētu aptuveni -78 °C temperatūru. Pēc saņemšanas nekavējoties pārbaudiet iepakojumu un nekavējoties pārvietojiet flakonus uz atbilstošu uzglabāšanas vietu. |
| Nosūtīšanas nosacījumi | Kriokonservētas šūnu līnijas tiek sūtītas uz sausā ledus apstiprinātā, izolētā iepakojumā ar pietiekamu dzesēšanas šķidruma daudzumu, lai visā transportēšanas laikā uzturētu aptuveni -78 °C temperatūru. Pēc saņemšanas nekavējoties pārbaudiet iepakojumu un nekavējoties pārvietojiet flakonus uz atbilstošu uzglabāšanas vietu. |
| Uzglabāšanas apstākļi | Ilgstošai uzglabāšanai flakonus ievietojiet šķidrā slāpeklī ar tvaika fāzi aptuveni -150 līdz -196 °C temperatūrā. Uzglabāšana -80 °C temperatūrā ir pieļaujama tikai kā īss starpposms pirms pārvietošanas uz šķidro slāpekli. |
Kvalitātes kontrole / Ģenētiskais profils / HLA
| Sterilitāte | Mikoplazmas piesārņojums tiek izslēgts, izmantojot gan uz PCR balstītus testus, gan uz luminiscenci balstītas mikoplazmas noteikšanas metodes. Lai pārliecinātos, ka nav baktēriju, sēnīšu vai rauga piesārņojuma, šūnu kultūras katru dienu vizuāli pārbauda. |
|---|