인간 1차 세포

인간 1차 세포란 무엇인가요?

1차 세포는 해당 조직을 가장 순수하게 나타내는 세포입니다. 이 세포들은 조직에서 분리되어 이상적인 조건의 배양 환경에서 안정적으로 증식할 수 있도록 처리됩니다. 이 세포들은 변형된 것이 아니라 조직에서 직접 유래했기 때문에 생체 내 상태를 더 가깝게 재현하며 정상적인 생리학적 특성을 나타냅니다. 이 때문에 세포 약리학, 독성학, 생리학(대사, 노화, 신호 전달 연구 포함) 연구에 유용한 모델로 활용될 수 있습니다. 원발 세포는 수명이 더 짧고 일정 횟수의 세포 분열 후 분열이 중단(또는 노화)되기 때문에, 연속 세포주보다 배양 및 유지 관리가 더 어렵다는 점을 유의해야 합니다. 기증자로부터 확보하거나 재배양 과정을 거친 1차 세포는 본질적으로 변이성이 있어 세포 신호 전달 경로 연구가 복잡해집니다. 신호 전달 연구를 시작하기 전에 연구자들은 흔히 사용되는 자극에 세포가 반응하는지 여부를 확인하기 위해 선별 검사를 수행합니다. 시간과 비용을 낭비하지 않기 위해, 선별 검사 전에 1차 세포를 자극하여 주요 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있습니다.

왜 인간 1차 세포를 사용할까요?

불멸화 세포주는 일반적으로 세포 분석에 사용됩니다. 그러나 과학자들은 세포주 사용으로 인한 생물학적 변화가 생리학적 중요성을 연구하는 데 해로울 수 있음을 인정해 왔습니다. 인간 1차 세포를 사용하면 세포 배양을 통해 얻은 데이터의 생리학적 가치가 향상되며, 생물학적 과정, 질병 진행 및 신약 개발 연구에 있어 그 중요성이 점점 더 부각되고 있습니다.

인간 1차 세포는 세포 간 및 세포 내 통신, 발생 생물학, 암, 파킨슨병, 당뇨병의 기전 연구 등 다양한 전임상 및 기초 생물학 연구 분야의 체외 연구에 널리 사용됩니다. 연구자들은 오랫동안 조직 기능을 연구하기 위해 불멸화 세포주를 사용해 왔으나, 명백한 돌연변이와 염색체 이상을 가진 세포주는 정상 세포나 질병의 초기 단계를 잘 대변하지 못할 수 있습니다. 이제 해당 조직에서 분리하여 1차 세포 배양 배지와 보충제에서 배양한 인간 1차 세포를 사용함으로써 특정 조직 세포 유형에 대한 보다 정확한 모델을 구축할 수 있게 되었습니다.

1차 세포 배양이란 무엇인가?

불멸화 세포주를 사용하는 대신, 1차 세포 배양은 체외에서 다세포 생물체로부터 직접 세포를 배양하는 것을 의미합니다. 영국과 같은 일부 국가에서는 1차 세포 배양이 세포주보다 생체 내 조직을 더 잘 대변한다는 사실이 법적으로 인정되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 1차 세포는 성장하기 위해 적절한 기질과 영양분이 필요하며, 일정 횟수의 분열 후에는 노화 표현형을 나타내어 영구적으로 분열을 중단하게 됩니다. 이 두 가지 요인이 세포주 개발의 동기가 됩니다. 자연적으로 불멸화된 1차 세포(예: HeLa 세포)와 인공적으로 불멸화된 1차 세포(예: HEK 세포) 모두 세포 배양에서 무기한으로 배양될 수 있습니다.

조직 유형별 인간 1차 세포

상피 세포, 섬유아세포, 각질 형성 세포, 멜라닌 세포, 내피 세포, 근육 세포, 면역 세포, 그리고 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포는 과학 연구에서 가장 흔히 사용되는 인간 1차 세포에 속합니다. 우선, 이러한 배양물은 이질적이며(조직 내에 존재하는 다양한 세포 유형이 혼합되어 있음), 체외에서 특정 기간 동안만 생존할 수 있습니다. 형질전환은 인간 1차 세포를 조작하여 무제한으로 재배양할 수 있게 하는 체외 과정입니다. 형질전환은 자연적으로 발생하거나, 화학 물질이나 바이러스에 의해 유도될 수 있습니다. 유전적 형질전환을 거친 후, 1차 배양 세포는 충분한 영양분과 공간이 제공된다면 무한히 분열하여 불멸화된 2차 세포주로 발전할 수 있습니다.

내피 세포

암 치료, 상처 치유, 세포 신호 전달 연구, 고처리량 및 고함량 스크리닝, 독성학 스크리닝 등은 연구 도구로서 1차 내피 세포를 활용함으로써 이점을 얻을 수 있는 분야 중 일부에 불과합니다.

각질세포

성인 인간의 피부 표피나 신생아의 포피에서 유래한 각질세포는 건선 및 암과 같은 피부 질환 연구에 중요한 역할을 합니다.

상피 세포

암 연구에서 독성학 조사에 이르기까지, 1차 상피 세포는 인체의 자연 방어 기전을 모델링하는 데 있어 매우 귀중한 자원임이 입증되었습니다.

섬유아세포

다능성 유도 만능 줄기세포(iPS)의 유도 및 상처 치유 연구는 1차 섬유아세포의 수많은 용도 중 일부에 불과합니다.

면역 세포

말초혈액 단핵구(PBMC)는 둥근 세포핵을 가진 혈액 내 단핵구입니다. 여기에는 주로 면역 반응 과정에서 중요한 기능을 수행하는 림프구와 단핵구가 포함됩니다. 말초혈액 단핵세포는 감염을 진단하거나 백신 접종에 의한 보호 효과를 확인하는 데 자주 사용됩니다. T 세포에 의해 매개되는 세포성 면역 반응에 대한 이해는 종종 매우 중요합니다.

멜라노사이트

색소인 멜라닌을 생성하는 특화된 피부 세포인 멜라노사이트는 상처 치유, 독성, 흑색종, 자외선(UV)에 대한 진피 반응, 피부 질환 및 화장품과 같은 주제를 연구하는 데 유용한 모델이 됩니다.

줄기세포

줄기세포는 매우 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 분화 능력 덕분에, 줄기세포는 인체 조직 및 건강 상태를 모형화하는 데 새로운 기회를 제공합니다.

중간엽 줄기세포

MSC라고도 알려진 중간엽 줄기세포는 골수, 지방(지방 조직), 제대 조직(워튼 젤리), 양수(태아를 둘러싼 액체) 등 다양한 인체 조직에서 채취할 수 있으며, 체외에서 증식시킬 수 있습니다. 이러한 성체 기질 줄기세포는 매우 다양한 세포 유형으로 발달할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이러한 세포 유형에는 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 피부세포, 각막세포 등이 포함됩니다.

평활근 세포

중공 장기 내에서는 1차 평활근 세포(SMCs)가 내벽을 덮고 수축 기능을 조절합니다. SMCs는 암 및 기타 질환 연구 외에도 고혈압성 섬유화를 모형화하는 데 활용될 수 있습니다.

1차 세포와 세포주

변형된 암 세포주에서와 같이 자연적인 돌연변이를 통해, 또는 암 유전자의 인공적 생성과 같은 의도적인 변형을 통해, 연속 세포주는 무한히 증식할 수 있는 잠재력(불멸화)을 얻게 되었습니다. 일반적으로 연속 세포주는 1차 세포보다 다루기 더 신뢰할 수 있고 편리합니다. 이들은 무한히 증식할 수 있으며 필수적인 데이터를 신속하게 확보할 수 있게 해줍니다. 그러나 연속 세포주의 사용에는 몇 가지 한계가 있습니다. 유전적으로 변형되었기 때문에 생리적 특성이 변화하여 생체 내 조건과 일치하지 않을 수 있으며, 다년간의 배양을 거치면서 이러한 특성이 더욱 변할 수 있다는 점이 그 예입니다.

1차 세포 배양의 발전

1차 세포는 다루기 어렵다는 악명이 높습니다. 그러나 1차 세포 배양 기술의 발전, 완전히 최적화된 프로토콜을 갖춘 상용 1차 세포의 보급, 그리고 적은 투입으로 수행 가능한 새로운 분석 기법 덕분에 이 과정은 그 어느 때보다 쉬워지고 있습니다.

2차원(2D) 세포 배양에서 3차원(3D) 세포 배양으로의 전환은 이 분야의 주요 이정표로 간주됩니다. 2D 배양에서는 조직 특이적 구조, 세포 간 상호작용, 기계적/생화학적 신호 전달이 약화될 수 있습니다. 따라서 이러한 배양의 생물학적 가치에는 한계가 있습니다.

반면, 3차원 세포 배양은 세포가 3차원 세포외 기질 내에서 증식하고 상호작용할 수 있게 합니다. 이를 통해 세포는 서로 및 세포외 기질과 상호작용할 수 있어, 3차원 배양이 생리학적으로 더 타당해집니다. 생체 내 반응을 예측하는 데 있어 이 방법의 정확성은 신약 발견 및 개발과 같은 분야에서 혁명적인 변화를 가져왔습니다. 이로 인해 환자로부터 유래한 오가노이드나 칩 상의 장기(organs-on-a-chip)와 같은 최첨단 기술은 신약 스크리닝 및 개발을 위한 매우 맥락에 충실한 모델을 제공합니다.

1차 세포 배양에서 1차 세포의 생성은 병목 현상을 일으키는 요인입니다. 이를 극복하기 위해서는 대개 더 많은 양의 조직이 필요하지만, 이를 확보하는 것은 어려울 수 있습니다. 그러나 분석 감도의 향상은 해결책을 제시하고 있습니다. 예를 들어, 시퀀싱, 웨스턴 블로팅, 질량 세포계측법(mass cytometry)을 포함한 단일 세포 기술을 활용하면 대량의 1차 세포를 배양해야 하는 필요성이 줄어듭니다.

1차 세포 배양의 유망한 전망

원시 세포 배양에 수반되는 전반적인 어려움은 기술 발전에 힘입어 점차 완화되고 있습니다. 이에 따라 이 방법은 세포 및 분자 생물학 연구와 실무 분야에서 다른 방법들을 빠르게 대체하며 ‘골드 스탠다드’로 자리 잡고 있습니다. 백신 제조, 장기 이식, 줄기세포 치료, 암 연구 등 수많은 분야에서 원시 세포 배양의 지속적인 발전으로 인해 큰 혜택을 얻을 것으로 기대됩니다.

1차 세포 배양 팁과 요령

세포 증식에 필요한 사항

1차 세포 배양의 가장 일반적인 두 가지 방법은 현탁 배양과 표면(2D) 배양입니다. 일부 세포(예: 말초혈 유래 세포)는 표면에 부착되지 않고 혈류 내에서 자유롭게 떠다닐 수 있습니다. 일부 세포주는 현탁 배양에서 잘 자라도록 공학적으로 개량되었으며, 이 경우 2차원(2D) 배양 조건에서는 달성할 수 없는 밀도에 도달할 수 있습니다. 체외에서 성장하기 위해 표면에 부착해야 하는 1차 세포를 부착 세포라고 하며, 여기에는 고형 조직에서 발견되는 세포들이 포함됩니다. 접착 특성을 개선하고 성장 및 분화에 필요한 기타 신호를 공급하기 위해, 이러한 세포는 일반적으로 코팅되지 않은 평평한 플라스틱 용기에서 배양되지만, 때로는 마이크로 캐리어를 사용하기도 합니다. 후자의 경우, 세포외 기질 단백질(콜라겐, 라미닌 등)로 코팅될 수 있습니다. 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 성장 인자와 사이토카인이 보충된 기본 배지로 구성됩니다. 세포 배양기는 특정 온도와 가스 혼합물(포유류 세포의 경우 일반적으로 37°C, 5% CO₂)에서 세포를 배양하고 유지하기 위해 사용되는 특수한 유형의 실험실용 인큐베이터입니다. 배양되는 세포의 종류에 따라 최적의 조건은 매우 다를 수 있습니다. 배양되는 세포의 종류에 따라 최적의 배양 배지는 pH, 포도당 농도, 성장 인자, 기타 영양소의 존재 여부 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 고유한 요인들의 조합을 갖게 됩니다.

1차 배양 확립 단계에서는 숙주 조직으로부터의 오염을 방지하기 위해 배지 내 항생제의 첨가가 필수적이다. 일부 항생제 요법에는 젠타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B의 조합이 사용됩니다. 그러나 일부 시약(예: 암포테리신 B)은 장기적으로 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로, 항생제를 장기간 사용하는 것은 권장되지 않습니다.

대부분의 1차 세포는 노화를 거치며, 일정 횟수의 개체군 배가 후 분열을 멈추기 때문에, 분리 후 세포를 생존 상태로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 장기적인 세포 생존력을 유지하려면 전문적인 세포 배양 기술과 이상적인 배양 조건(적절한 배지, 적정 온도, 적절한 가스 혼합물, 적정 pH, 적절한 농도의 성장 인자, 영양소 및 포도당의 존재 등)이 필요합니다. 배지를 보충하는 데 사용되는 성장 인자의 상당수는 동물 혈액에서 추출되므로(혈액 유래 성분은 오염 가능성이 있음), 이러한 성분의 사용을 최소화하거나 아예 피하는 것이 좋습니다. 또한 무균 기법을 사용하는 것도 중요합니다.

재배양 및 유지

분리된 세포가 배양 접시 표면에 부착되면, 이는 유지 단계의 시작을 의미합니다. 부착은 일반적으로 배양 시작 후 24시간 후에 발생합니다. 세포는 일정 밀도 비율에 도달하고 활발히 증식하고 있을 때 재배양해야 합니다. 포화 상태 이후의 세포는 분화를 겪거나 패싱 후 증식 속도가 느려질 수 있으므로, 1차 세포 배양은 100% 포화 상태에 도달하기 전에 재배양하는 것이 가장 좋습니다.

신선한 배지에서 재배양하면 부착 의존성 세포의 지수적 성장을 유지할 수 있습니다. 단층 배양 세포를 재배양하면 세포 간 및 세포 내 표면 상호작용이 중단됩니다. 트립신/EDTA와 같은 저농도의 단백질 분해 효소를 사용하여 단층 또는 조직에서 부착된 1차 세포를 추출합니다. 세포가 분해되어 단일 세포 용액으로 희석된 후, 세포 수를 계수한 다음 새로운 배양 용기로 옮겨 재부착 및 증식을 유도합니다.

동결 보존 및 회복

냉동 보존은 생세포를 저온에서 동결시켜 보존하는 방법입니다. 인간 1차 세포를 냉동 보존하고 해동하면 보관 및 사용 중 세포 사멸과 손상을 방지할 수 있습니다. 인간 1차 세포는 DMSO 또는 글리세롤을 사용하여 (적절한 온도와 제어된 동결 속도로) 냉동 보호 처리됩니다. 얼음 결정 형성을 방지하기 위해 동결 과정은 분당 -1 °C씩 점진적으로 진행되어야 합니다. 장기 보관을 위해서는 액체 질소(-196 °C) 또는 -130 °C 이하의 온도가 필요합니다.

냉동된 세포를 37 °C 수조에 약 1~2분간 담가두기만 하면 냉동 보존된 세포를 해동할 수 있습니다. 인간 1차 세포는 냉동고에서 해동한 후 원심분리해서는 안 됩니다(냉동 보존에서 회복되는 과정에서 손상에 극도로 민감하기 때문입니다). 해동 직후 세포를 배양 접시에 접종하기에 적합하며, 접종 후 첫 24시간 동안 배양에서 세포 부착을 촉진합니다. 1 냉동 보존된 1차 세포가 부착된 후에는 사용된 배지를 반드시 제거해야 합니다(DMSO는 1차 세포에 유해하며 해동 후 생존율을 떨어뜨릴 수 있기 때문입니다).